[发明专利]一种利用纳米二氧化硅包裹荧光蛋白的方法

说明书

技术领域

    本发明涉及一种利用纳米二氧化硅包裹荧光蛋白的方法，属于纳米无机材料及生物化学领域。

背景技术

纳米二氧化硅是一种无毒、生物相容性好的无机纳米材料，且其表面易于修饰和改性，被广泛的应用于生物标记、纳米探针、载药体系等生物医学领域。利用纳米二氧化硅包裹特定分子制备特殊材料应用十分广泛，如利用纳米二氧化硅包裹药物、利用纳米二氧化硅包裹荧光物质提高量子产率等, 但是其潜在生物毒性是无法回避问题。本发明首次报到二氧化硅包裹荧光蛋白，具有优异生物相容性和分散性并成功应用于小动物活体成像。

发明内容

根据现有技术存在的缺陷，本发明的目的是提供一种利用纳米二氧化硅包裹荧光蛋白的方法，并且适用于其他蛋白质，具有以下的过程和步骤：

a. 3-氨丙基三乙氧基硅烷与荧光蛋白共价连接：取1-100 mg的荧光蛋白和50-1000 ul的3-氨丙基三乙氧基硅烷，在10-500 mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和10-500 mg N-羟基丁二酰亚胺存在下反应，经G 25脱盐和1000-10000 g超滤即得产物； 

b. 包裹近红外荧光蛋白的纳米二氧化硅的制备：将50-500 mg的碱性氨基酸加入去离子水中充分搅匀，加入上述0.1-1 ml 3-氨丙基三乙氧基硅烷与荧光蛋白共价连接产物，再加入10-100 ul四乙氧基硅烷和环己烷，室温搅拌反应完全后，3500g 超滤洗涤3-5 次除去氨基酸等杂质，即可得到包含荧光蛋白的纳米二氧化硅颗粒。

与现有技术相比，本发明具有如下的突出的优点：

本发明利用一种简单的方法制备包裹荧光蛋白的纳米二氧化硅颗粒，将荧光蛋白包裹在纳米二氧化硅内部，通过包裹改善了荧光蛋白的稳定性，具有更好的热稳定性和pH稳定性，且具有不易被酶解和荧光不易被淬灭等优良的性能，大大扩展了蛋白的利用范围和领域。将所得的包含荧光蛋白的纳米二氧化硅颗粒分散在生理盐水中，通过小动物尾静脉注射，在小动物活体成像系统中能够成功的进行小动物光学显像。

附图说明

    图1为本发明所得包含近红外荧光蛋白的纳米二氧化硅颗粒的透射电子显微镜（TEM）照片图。

    图2为本发明所得包含近红外荧光蛋白的纳米二氧化硅颗粒的动态光散射（DLS）图。

图3为本发明所得为同等浓度下的包含近红外荧光蛋白的纳米二氧化硅颗粒与近红外荧光蛋白的荧光光谱图。

图4为本发明所得包含近红外荧光蛋白的纳米二氧化硅颗粒与近红外荧光蛋白在小鼠肝脏S9体系中对比曲线图。

图5为本发明所得包含近红外荧光蛋白的纳米二氧化硅颗粒与近红外荧光蛋白酶解对比曲线图。

图6为本发明所得直接包裹近红外荧光蛋白的纳米二氧化硅颗粒小鼠尾静脉注射的小动物活体成像图。

具体实施方式

    下面结合附图，将本发明的具体实施例进一步说明于后。

实施例1

a. 3-氨丙基三乙氧基硅烷与近红外荧光蛋白共价连接：取一定量的近红外荧光蛋白（eqFP650），溶于14.6毫升 pH为7.5的磷酸盐缓冲液，加入200 毫克1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐, 250毫克N-羟基丁二酰亚胺，再加入400 微升3-氨丙基三乙氧基硅烷，磁力搅拌24小时，经脱盐和超滤即得产物；

b. 包裹近红外荧光蛋白（eqFP650）的纳米二氧化硅的制备：取75mg 赖氨酸加入15ml去离子水中充分搅匀，加入2.1ml上述3-氨丙基三乙氧基硅烷与荧光蛋白共价连接产物，再加入18ul四乙氧基硅烷和12ul环己烷，室温剧烈搅拌反应12小时，在逐步加入18ul四乙氧基硅烷和12ul环己烷室温搅拌12小时至完全反应。超滤洗涤(3500g /分左右)数次除去氨基酸等杂质，即可得到包含近红外荧光蛋白的纳米二氧化硅颗粒。

c. 将所得的包含近红外荧光蛋白（eqFP650）的纳米二氧化硅颗粒分散在生理盐水中，通过小鼠尾静脉注射。在小动物活体成像系统中能够成功的进行小动物光学显像。

实施例2