[发明专利]一种用于检测对虾五种病毒的引物、液相芯片及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及检测芯片领域，尤其涉及一种用于检测对虾病毒的引物、液相芯片及其用途。

背景技术

随着水产养殖规模的扩大，特别是在集约化养殖的情况下，养殖水体、环境的恶化，养殖密度的增大，水体富营养化和饲养管理不当等，再加上对虾属无脊椎动物，缺乏特异性免疫系统等，导致近年来养殖病害的扩大和蔓延，甚至发展到愈演愈烈的趋势。对虾病毒尚不能进行体外培养，对虾病毒病不仅无特效药可治，而且造成大规模毁灭性的死亡。更令人担忧的是各种病害防治还只是停留在化学治疗水平，为防止继发和混合感染，药物滥用已造成病原菌广泛耐药，同时水产品的药物残留已成社会关注的问题，甚至导致对虾出口受阻，影响国际名声，危害消费者的健康，严重妨碍对虾养殖业的健康发展。为此，建立快速、灵敏、特异的对虾病毒诊断技术不仅能快速确诊病因，及时检测病害发生及发展趋势，而且也是今后加强科学养殖管理，建立进出口对虾种苗及其产品的检验检疫体系，实现现代化养殖所必需的。

对虾病害检测技术的研究在国内起步相对较晚，但近年来随着分子生物学技术的应用，有力推动了对虾病原检测的发展。国内在对虾病毒的检测方面分别建立了几种主要病原的免疫学技术、核酸探针及PCR检测技术的研究。但由于国内养殖状况主要是个体、分散和粗放等形式，对致病病原体的种苗检测、早期监控、定期检测等病害检测体系基本上没有建立，往往是发病后才引起关注，这与国外大型养殖公司相比，还存在着相当大的差距。

基因芯片是分子生物学和微细加工技术相结合的产物，目前基因芯片技术广泛应用于基因图绘制、表达谱分析、多态性研究、序列测定，同时也在疾病研究和病毒感染诊断等方面得到了广泛的应用。鉴于我国对虾病毒病发生流行时往往是几种病毒病混合、交叉或继发感染，仅凭疾病的流行特征、发病症状及组织学病理等方法是很难对其进行准确的诊断，更何况有些表面健康的虾，由于受到水质环境、饵料和病毒本身特性的影响都或多或少的携带有一种或几种病毒。目前人们最常采用的PCR技术以其高灵敏度虽然为病毒感染的诊断提供了一种有力的工具，但同时非特异性产物的增多也容易导致临床诊断错误，故必须将PCR产物进行测序，否则检查结果不可信。特别是需要大批量的同时检测几种病毒病时，采用单一PCR方法逐一检测时，则比较费时、费力和费钱，难于推广。

白斑综合症病毒（WSSV）、桃拉综合征病毒（TSV）、黄头病病毒（YHV）、传染性皮下及造血组织坏死病病毒（IHHNV）和传染性肌肉坏死病病毒（IMNV）是感染对虾最重要的病毒之一。因此，目前急需一种成本低，方法简单，准确率高的检测五种病毒的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种简便快捷、准确率高、特异性好、灵敏度高，高通量的检测对虾病毒的方法。

为实现上述目的，本发明提供检测对虾一至五种病毒液相芯片检测引物。

其上游引物具有R1-R2-R3所表示的序列，，其中R1与液相芯片的微球连接序列反向互补，R3与待检测序列互补，R2为多聚dT，或寡聚四聚乙二醇，或（CH₂）_n间臂，n≥3；优选R2为（CH₂）_n间臂，n为12或18；更优选R2为（CH₂）_n间臂，n为18；下游引物标记生物素。

其引物序列为以下至少一对：检测WSSV的引物：上游引物中R1为SEQ ID NO:1，R3为SEQ ID NO:2，下游引物为SEQ ID NO:3，并5’端标记生物素；检测TSV的引物：上游引物中R1为SEQ ID NO:4，R3为SEQ ID NO:5，下游引物为SEQ ID NO:6，并5’端标记生物素；检测YHV的引物：上游引物中R1为SEQ ID NO:7，R3为SEQ ID NO:8，下游引物为SEQ ID NO:9，并5’端标记生物素；检测IHHNV的引物：上游引物中R1为SEQ ID NO:10，R3为SEQ ID NO:11，下游引物为SEQ ID NO:12，并5’端标记生物素；检测IMNV的引物：上游引物中R1为SEQ IDNO:13，R3为SEQ ID NO:14，下游引物为SEQ ID NO:15，并5’端标记生物素。

本发明还涉及一种用于检测对虾一至五种病毒的液相芯片，其特征是，包括：

1）所述引物；

2）偶联一定核苷酸序列的微球，所述序列选自SEQ ID NO:16-20，并能相应的与1）中引物序列互补配对。