[发明专利]一种检测活性细菌含量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测活性细菌含量的方法，特别涉及一种通过联合使用CTC染料染色和流式细胞仪来检测活性细菌含量的方法。

背景技术

细菌总数是指1mL水样中的好氧菌、兼性厌氧菌和异养菌在营养琼脂培养基中，于37℃培养24h后，所生长细菌菌落的总数（《水和废水监测分析方法》（第三版））。细菌总数作为我国《生活饮用水卫生标准》（GB5749-2006）规定的水质常规指标之一，在评价水质方面具有很大的参考价值。

营养琼脂平板培养法具有一定的局限性，自然环境中只有一小部分的细菌可以在平板上被计数，有研究表面，海水中可被培养法检测到的细菌只占细菌总数的0.8%。此外，很多厌氧菌和兼性菌无法利用平板培养法检测。不同细菌对温度、培养时间、培养基等培养条件十分敏感，营养琼脂平板培养法难以对各种菌同时进行有效的检测。并且，营养琼脂平板培养法通常需要的检测时间较长（需24h）。同时，大量研究表明，很多细菌在外界环境压力（如高温）下，可进入“具有活性但无法培养”（Viablebut not culturable,VBNC）的状态，致使某些病原菌无法在平板培养基上形成菌落，但仍然保持一定代谢能力和致病性，VBNC状态病原菌能够在适宜条件下恢复其感染性。此外，在平板中的细菌不会全部以相同的速度生成菌落，形成的菌落大小也不同，如果生成了一些微小的菌落，在计数过程中可能被漏掉。因此，平板培养法不能够准确反映水中活性细菌总量。

CTC染料（一种氧化还原性染料，英文名称为5-cyano-2,3-ditolyl tetrazoliumchloride，中文名称为5-氰基-2,3-二甲苯基氯化四氮唑，结构式见式（Ⅰ）。

式（Ⅰ）。

CTC染料是一种无色的可渗透细胞膜的物质，可以被细菌细胞通过电子传递链还原，在细胞内形成红色荧光沉淀物质CTF(CTC-Formazan，在450/630nm下被激发)，生成CTF的含量与CTC浓度、孵育时间有关。可以还原CTC并产生荧光的细胞即具有呼吸活性的细胞(CTC+)。同时，CTC染料相比与其它氧化还原染料还具有一个独特的优势，即其可以与好氧菌、厌氧菌以及兼性细菌反应。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测活性细菌含量的方法，特别涉及一种通过联合使用CTC染料染色和流式细胞仪来检测活性细菌含量的方法（简称CTC-流式细胞仪法或CTC-FCM法）。

本发明提供的第一种检测活性细菌含量的方法，是将CTC染料与待测液体样本共孵育，然后通过流式细胞仪检测所述待测液体样本中的活性细菌含量。

所述“通过流式细胞仪检测所述待测液体样本（如水样）中的活性细菌含量”的实现方法如下：采用流式细胞仪，在450/630nm的激发光下计数可发出红色荧光的物质，每个可发出红色荧光的物质代表一个活性细菌。

所述方法中，所述共孵育的初始体系具体可由CTC水溶液、待测液体样本（或待测液体样本的稀释液）和NaCl水溶液组成。所述方法中，所述共孵育的初始体系具体可由20μL CTC水溶液、10μL待测液体样本（或待测液体样本的稀释液）和70μL0.85g/100mL NaCl水溶液组成。所述方法中，所述共孵育的初始体系中，所述CTC染料的浓度具体可为2mmol/L。

所述共孵育的时间具体可为3小时。

所述细菌具体可为大肠杆菌。

上述方法中，流式细胞仪参数设置可为：FL1:4.11;FL2:6.29;FL3:5.47；每次测量的体积为可50μL。

本发明提供的另一种检测活性细菌含量的方法，是将CTC染料与待测固体样本在液相体系中共孵育，然后通过流式细胞仪检测所述待测固体样本中的活性细菌含量。

所述“通过流式细胞仪检测所述待测固体样本中的活性细菌含量”的实现方法如下：采用流式细胞仪，在450/630nm的激发光下计数可发出红色荧光的物质，每个可发出红色荧光的物质代表一个活性细菌。

所述方法中，所述共孵育的初始体系具体可由CTC水溶液、待测固体样本的悬浮液和NaCl水溶液组成。所述方法中，所述共孵育的初始体系具体可由20μL CTC水溶液、10μL待测固体样本的悬浮液和70μL 0.85g/100mL NaCl水溶液组成。所述方法中，所述共孵育的初始体系中，所述CTC染料的浓度具体可为2mmol/L。

所述共孵育的时间具体可为3小时。

所述细菌具体可为大肠杆菌。