[发明专利]检测伏马毒素的ELISA试剂盒的制备及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于检测技术领域，具体地涉及一种用于定量检测坚果、谷物和谷物产品中的伏马毒素残留量的ELISA试剂盒及检测方法。

背景技术

伏马毒素( Fumonisins)是一组主要由串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)在一定温度和湿度条件下繁殖所产生的真菌毒素。1988 年，Gelderblom 等首次从玉米中分离出伏马毒素B1。伏马毒素在自然界中分布广泛，且危害性大，逐渐引起了国内外学者的高度重视。目前，已发现的伏马毒素结构类似物主要分为A、B、C、P 四类，包括 FA1、FA2、FB1、FB2、FB3、FB4、FC1、FC2、FC3、FC4、FP1等。

伏马毒素（B1，B2，和B3)是由镰孢菌(霉)属念珠菌产生的真菌毒素。在世界范围内都发现了伏马毒素污染玉米的现象。研究表明伏马毒素可以诱发老鼠患肝癌，猪的肺水肿和马的脑脊髓白质病。在一些地区中玉米中伏马毒素含量很高，在这些地区（比如中国和非洲）人的食道癌具有高发性。

研究证实伏马毒素可致马大脑白质软化症( EL-EM )，神经性中毒而表现意识障碍、失明和运动失调等症状, 严重者甚至造成死亡。对猪造成肺水肿综合征 ( PPE )，并能造成肝脏和食道损伤。伏马毒素还可引起灵长类动物的动脉粥样硬化样改变，诱发大鼠肝癌，与人类食道癌的发生也密切相关。国际癌症研究机构与加利福尼亚环境保护机构已宣布伏马毒素为人类潜在的致癌物质(2B级致癌物)。

基于伏马毒素的污染范围较广，毒性作用也较大，许多国家和地区对伏马毒素进行了系统研究。但目前国际上对于食品与饲料中伏马毒素的限量及检测方法尚无统一标准。瑞典规定人类食物中伏马毒素的限量为1 mg/kg，美国食品与药品管理局(FDA)发布了供人类食用的玉米和玉米产品伏马毒素的最高限量指导性公告，规定人类食用玉米中伏马毒素最高限量为 2 mg/kg。同时，FDA 的畜牧医学中心(CVM)也发布了动物饲料中伏马毒素的最高限量指导性公告，规定其限量范围为 1~ 50 mg/kg。在FAO/WHO联合会上关于食品添加剂的会议( 2001年2月)中规定，伏马毒素对人体的安全限量为每天摄入量按人体体重算 FB1、FB2、FB3量不超过2 g/kg。FB1以低于最大限量为最好，对 FB2、FB3的限制相对 较宽。我国对此的相关法规也正在制定中。在出入境检验检疫行业推荐标准中, 液相色谱法对伏马毒素B1 、B2的测定低限均为0.05 mg/kg，而酶联免疫吸附法则推荐检测低限为12 g /kg。这些行业标准和检测方法均可为我国制定国家标准提供一定的依据。

免疫学技术具有敏感、特异、简便的特点，近年来已被应用于伏马毒素残留检测。目前伏马毒素的免疫学检测试剂盒大多来自进口，而国内有关伏马毒素的试剂盒的开发还相对落后。本发明旨在建立一种检测伏马毒素的ELISA试剂盒的制备及检测方法。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明提供了检测伏马毒素的ELISA试剂盒，其检测灵敏、准确、快速，操作简便、特异性强，适用于大批样品的检测。本发明提供了检测伏马毒素的ELISA试剂盒的制备及检测方法。

检测伏马毒素的ELISA试剂盒的制备及检测方法，包括酶标板、伏马毒素标准品、伏马毒素抗体工作液、伏马毒素酶标二抗工作液、底物液A、底物液B、终止液和浓缩洗涤液。

检测伏马毒素的ELISA试剂盒的制备及检测方法，包括以下步骤：酶标板的制备、伏马毒素标准品的制作、伏马毒素单克隆抗体及其工作液的制备、伏马毒素酶标二抗工作液的制备、洗涤液的制备、底物液A的制备、底物液B的制备、终止液的制备。

其进一步特征在于：所述的伏马毒素包被抗原是将伏马毒素半抗原与载体蛋白偶联得到的，该载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)；用0.05 mol/L pH 9.6的碳酸盐(CBS)缓冲液作为包被液，将伏马毒素抗原稀释成1：10000比例，100 μL/孔，37℃放置2 h，取出酶标板甩掉板内液体，用稀释后的浓缩洗涤液300 μL/孔，洗板2次，30 s/次；然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封闭，180 μL/孔，37℃放置1.5 h，弃去封闭液，拍干后的酶标板放置恒温间(25℃)晾干；抽检合格后将酶标板真空密封后置4℃下保存。

所述的伏马毒素标准品浓度分别为0 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、150 ng/mL。