[发明专利]检测伏马毒素的ELISA试剂盒的制备及检测方法

权利要求书

1.检测伏马毒素的ELISA试剂盒的制备及检测方法，包括酶标板、伏马毒素标准品、伏马毒素抗体工作液、伏马毒素酶标二抗工作液、底物液A、底物液B、终止液和浓缩洗涤液。

2.检测伏马毒素的ELISA试剂盒的制备及检测方法，包括以下步骤：酶标板的制备、伏马毒素标准品的制作、伏马毒素单克隆抗体及其工作液的制备、伏马毒素酶标二抗工作液的制备、洗涤液的制备、底物液A的制备、底物液B的制备、终止液的制备。

3.根据权利要求2所述伏马毒素的检测伏马毒素的ELISA试剂盒的制备及检测方法，其特征在于：所述的伏马毒素包被抗原是将伏马毒素半抗原与载体蛋白偶联得到的，该载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)；用0.05 mol/L pH 9.6的碳酸盐(CBS)缓冲液作为包被液，将伏马毒素抗原稀释成1：10000比例，100 μL/孔，37℃放置2 h，取出酶标板甩掉板内液体，用稀释后的浓缩洗涤液300 μL/孔，洗板2次，30 s/次；然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封闭，180 μL/孔，37℃放置1.5 h，弃去封闭液，拍干后的酶标板放置恒温间(25℃)晾干；抽检合格后将酶标板真空密封后置4℃下保存。

4.根据权利要求2所述伏马毒素的检测伏马毒素的ELISA试剂盒的制备及检测方法，其特征在于：所述的伏马毒素标准品浓度分别为0 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、150 ng/mL。

5.根据权利要求2所述伏马毒素的检测伏马毒素的ELISA试剂盒的制备及检测方法，其特征在于：所述的伏马毒素蛋白质偶联物单克隆抗体是采用伏马毒素人工抗原免疫兔所得，该抗体工作液用抗体稀释液稀释成1：40000。

6.根据权利要求2所述伏马毒素的检测伏马毒素的ELISA试剂盒的制备及检测方法，其特征在于：所述的伏马毒素酶标二抗工作液用酶标二抗稀释液稀释成1：2000比例；所述底物液A为含有0.5 mmol/L的过氧化氢脲的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液；所述底物液B为四甲基联苯二胺的乙醇溶液；所述终止液为2 mol/L的硫酸；所述浓缩洗涤液是10倍浓缩洗涤液，其包含0.5% 吐温-20，0.01 mol/L的PBST，pH值范围7.0-7.5之间。

7.权利要求2所述的检测伏马毒素的ELISA试剂盒的制备及检测方法，基于抗原抗体进行间接竞争酶联免疫反应，该方法包括以下步骤：

(1)预处理待测样品，即将待测试的样品处理为液体样品，或者用有机溶剂提取待测样品，并将其复溶于样品稀释液工作液中；

(2)将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温（20～25℃）平衡30 min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀；

(3)取包被有伏马毒素抗原的酶标板，加标准品/样本50 μL/孔到对应的微孔中；

(4)加入伏马毒素酶标二抗工作液，50 μL/孔，然后加入伏马毒素抗体工作液，50 μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温25℃避光环境中反应30 min；

(5)小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液260 μL/孔，充分洗涤4~5次，每次间隔10 s，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破)；

(6)加入底物液A 50 μL/孔，底物液B 50 μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应15～20 min；

(7)加入终止液50 μL/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450 nm处或双波长450/630 nm检测，测定每孔吸光度值（请在5 min内读完数据）；

(8)以标准品测试的吸光度值与标准品的浓度对数值绘制标准曲线，对照标准曲线计算样品中伏马毒素的含量。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述处理后的样品是经过以下处理的样品：

(1)配制90%的甲醇溶液（每个样品需要：4 mL蒸馏水+36 mL甲醇）；

(2)研磨代表性样品（使50%的样品可以通过一个20目的滤网）；

(3)称量20 g研磨过滤后的样品加入40 mL 90%的甲醇溶液，样品稀释比为1：2(w/v)；

(4)在密封的容器里混合，震荡涡旋1 min；

(5)静置、用滤纸（Whatman #1）过滤5-10 mL以上处理的液体，收集滤液；

(6)以1：20的比例稀释滤液（取0.1 mL滤液然后加入1.9 mL的蒸馏水或去离子水），混匀待测 。