[发明专利]携带双链RNA靶抗原和中和抗原的假病毒颗粒疫苗

说明书

技术领域  本发明涉及一种携带双链RNA靶抗原和中和抗原的假病毒颗粒疫苗，该疫苗可进行基因转移、免疫和疫苗接种，属于生物技术领域。 

背景技术  慢病毒是一种RNA病毒，属于逆转录病毒科，因其病毒颗粒中含有依赖RNA的逆转录酶而得名。慢病毒基因主要编码gag，pol和env3个基本的结构蛋白，以及4个辅助蛋白和2个调节蛋白。该科病毒包括人免疫缺陷病毒(HIV)，猴免疫缺陷病毒(SIV)，白血病病毒等，其中以HIV-1的研究最多，并在相关研究的基础上发展出慢病毒载体系统，被广泛应用于基因转导与基因表达等方面的研究[1-3]。 

慢病毒载体的构建的基本原理就是将HIV-1基因组中的顺式作用元件和编码反式作用因子的序列进行分离。整个载体系统由包装部分和载体部分构成：包装部分去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列，但能够反式提供产生病毒颗粒所需的蛋白；载体部分则含有包装、逆转录和整合所需的HIV-1顺式作用序列，并具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。载体包含的结构基因包括：编码病毒的核心蛋白的gag基因，基因编码病毒复制所需酶类的pol，编码病毒的包膜糖蛋白的env基因，以及编码切割蛋白前体所需的蛋白酶的pro基因[4]。1996年，为了进一步降低两部分基因发生同源重组而生成具有复制能力的病毒的可能性，Naldini等人采用表达水疱性口炎病毒(VSV)糖蛋白G的质粒和双嗜性小鼠白血病病毒(MLV)包膜蛋白Env的质粒，取代表达HIV本身包膜蛋白Env的质粒，包装获得了以HIV-1gag pol为骨架，以VSV-G或MLV-E蛋白作为包膜的嵌合病毒。该方案突破了最初的HIV-1载体仅对CD4+细胞的亲嗜性限制，并且病毒滴度可达到10⁷～10⁸TU/ml。这为采用逆转录病毒载体进行其他病毒的包膜蛋白功能研究提供了方便[5-6]。 

通过对载体序列的优化和改造，慢病毒载体作为基因治疗工具已有大量文献报导[7-9]。与其他病毒载体相比，其优点主要表现为：1.能高效转导广泛的细胞(包括DC细胞)。2.针对载体骨架的免疫原性较弱，可多次反复加强免疫。3.体外转导特异抗原的DC可引起较强的体内外细胞应答。但是，单纯采用慢病毒载体作为疫苗，其需要能够稳定、永久地整合到宿主染色体上，通过持续表达目的蛋白刺激机体才能产生相应的免疫反应，从生物安全性方面而言，这是一个极大的缺陷。所以，本发明着眼于采用慢病毒载体转染细胞包装获得的假型病毒颗粒作为疫苗应用[10-12]。 

Toll样受体(Toll-like receptors，TLR)是参与非特异性免疫的一类极其重要的蛋白受体，是连接天然免疫和特异性免疫的桥梁。当微生物突破机体的物理屏障，如皮肤、粘膜等时，TLR可以识别它们并激活机体产生免疫细胞应答。新近研究发现，病毒复制的中间产物双链RNA能被TLR3特异识别，通过激活NF-κB和干扰素IFN-β前体诱导炎症细胞释放I型干扰素，从而增强抗原特异性CD8+T细胞应答，促进树突状细胞的抗原呈递，激活抗病毒天然免疫[13-16]。因此本发明将能编码病原蛋白的双链RNA引入假病毒颗粒，一方面可利用其与TLR3的结合激活天然免疫，另一方面可通过介导其在宿主细胞的表达从而诱导产生病原特异 的细胞免疫反应。 

本发明具有以下特点：1.利用反式互补技术，可利用慢病毒载体快速获得携带天然构象中和抗原的假型病毒颗粒，并可对包膜蛋白进行人工突变快速获得相应的病毒样颗粒。2.与其他蛋白亚单位疫苗相比，假病毒颗粒更稳定，并可通过超离方法或超滤浓缩纯化。3.对于难以培养或表达的病毒糖蛋白以及存在生物安全隐患的病毒，假病毒颗粒的制备是一种可选择的替代途径。4.结合双链RNA佐剂效应的假病毒颗粒疫苗可兼顾病毒颗粒样(VLP)疫苗与DNA疫苗两者的优势，同时激发天然免疫，和抗原特异的体液免疫与细胞免疫，可以用于多次同型或异型疫苗联合免疫。 

基于以上特点，通过基因改造获得携带双链RNA靶抗原和中和抗原的假病毒颗粒疫苗进行基因转移、免疫和疫苗接种相关应用具有良好的前景。 

发明内容：

本发明的目的是提供一种免疫效果好、安全、制备周期短的采用假型慢病毒颗粒的新型疫苗及其制备方法。该型疫苗可以刺激机体产生体液与细胞双重免疫应答，可用于防治HCV，流行性感冒等病毒感染性疾病。 

在本发明的第一方面，提供了包装获得假型慢病毒颗粒所需的三质粒包装系统。具体包括： 

1.包装质粒pCMVDR8.2D64E：整合酶区域第64位氨基酸D(GAT)突变为E(GAG)，使其成为整合酶缺陷的包装载体。