[发明专利]绿豆过敏原抗体及其制备方法与应用

权利要求书

1.绿豆过敏原多克隆抗体使用绿豆过敏原蛋白作为免疫原免疫兔子和小鼠进行制备。

2.权利要求1所述的绿豆过敏原蛋白兔多抗的制备方法，其特征在于使用下述步骤制得：

初次免疫：取1mg纯化的绿豆过敏原蛋白溶于0.9％的NaCl溶液和弗氏完全佐剂等体积所配制的溶液中，采用皮下和肌肉注免疫雌性大白兔；

加强免疫：用0.5mg上述人工抗原溶于0.9％的NaCl溶液和弗氏不完全佐剂等体积所配制的溶液，初免后进行四次加强免疫，加强免疫分别于初次免疫后2周、4周和6周后免疫三次，此后间隔一个月，第五次免疫完后7-10天时由兔子的耳缘静脉取血，进行效价检测进行动物免疫；

抗体纯化：定时监测动物抗体效价，当抗体对绿豆过敏原蛋白的效价达到1∶150000时，采集血液，并离心获得抗血清，使用ProteinA-Sepharose4B免疫层析亲利柱对抗血清进行纯化，得到纯化的兔抗多克隆抗体。

3.权利要求1所述的绿豆过敏原蛋白鼠多抗的制备方法，其特征在于是用下述步骤制得：

免疫：免疫动物选用，，。洁净等级：SPF级。注射方式；免疫周期：

初次免疫：取0.1mg上述纯化的绿豆过敏原蛋白溶于0.9％的NaCl溶液和弗氏完全佐剂等体积所配制的溶液中，采用腹腔注射免疫7-8周大BALB/c雌性小鼠；

加强免疫：取0.1mg上述纯化的过敏原蛋白溶于0.9％的NaCl溶液和弗氏不完全佐剂等体积所配制的溶液中，在除免后进行加强免疫，此后每两周一免，免疫四次；最后一次免疫七天后对小鼠摘眼球取全血；

抗体纯化：定时监测动物抗体效价，当抗体对一定的包被抗原达到适宜效价时，采集血液，并离心获得抗血清。

4.权利要求1所述的绿豆蛋白过敏原和抗体在免疫检测方法中的应用，其特征在于方法如下：

(1)包被：纯化后的兔抗绿豆蛋白抗体经包被液稀释，然后以100μL/well包被于酶标板上。4℃孵育12-16小时后弃去孔中液体，用PBST洗液洗板3次，每次2分钟。

(2)封闭：在酶标板中加入200μL/well封闭液，室温封闭1小时后弃去封闭液，用PBST洗液洗板3次，每次2分钟。

(3)加样：加入梯度稀释的绿豆蛋白溶液，100μL/well。室温孵育1小时后弃去孔中液体，用PBST洗液洗板4次，每次2分钟。

(4)加鼠抗血清：将鼠抗绿豆蛋白血清用PBS稀释，加入酶标板中100μL/well，室温孵育1小时，然后用PBST洗液洗板4次，每次2分钟。

(5)加酶标二抗：加入PBS稀释10000倍的HRP标记的羊抗鼠二抗，100μL/well，室温反应30分钟后用PBST洗液洗板5次，每次2分钟。 

(6)显色：提前15分钟配制好底物溶液，每孔中加入100μL，室温暗处显色20分钟。

(7)终止：在每孔中加50uL终止液。

(8)读数：在双波长方式(450-650nm)下用酶标仪读取吸光度值(OD值)。