[发明专利]一对双钩巢粉虱特异性SS-COI引物及快速PCR检测方法和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体地，本发明一对双钩巢粉虱特异性SS-COI引物及快速PCR检测方法和试剂盒。

背景技术

双钩巢粉虱Paraleyrodes pseudonaranjae Martin，属同翅目、粉虱科、巢粉虱属，是一种世界性检疫害虫。双钩巢粉虱的植物寄主较多，有30科49属63种，分别为芸香科9种，桑科6种，豆科和茜草科各5种，大戟科4种，番荔枝科3种，棕榈科、樟科、桃金娘科、藤黄科、杜鹃花科、野牡丹科及无患子科各2种，旅人蕉科、蝶形花科、漆树科、菊科、三白草科、锦葵科、使君子科、木棉科、木兰科、杜英科、榆科、买麻藤科、山茶科、冬青科、金缕梅科、五茄科、菝葜科等各1种。其中，樟科Lauraceae、旅人蕉科Strelitziaceae、使君子科Combretaceae、木棉科Bombacaceae、菊科Compositae、木兰科Magnoliaceae和杜英科Elaeocarpaceae等7科为双钩巢粉虱寄主植物的首次报道，新记录寄主植物15种。而且，随着双钩巢粉虱入侵区域的逐渐扩大和定居时间的推移，其寄主植物的种类和危害程度有进一步增加的趋势。双钩巢粉虱以成虫和若虫进行为害，其危害方式主要包括两个方面。其一是直接危害，即，以成虫和若虫在叶片背面及正面刺吸寄主植物汁液，由于其繁殖能力强，发育速度快，虫口密度大，使寄主植物的生长发育严重受阻，叶片变黄、畸形乃至提前落叶，长势明显衰弱；其二是间接危害，即，成虫和若虫在寄主植物叶片背面分泌大量的蜡粉、蜡丝和蜜露，使叶片背面呈现一片雪白，并同时诱发严重的煤烟病，使叶片表面覆盖一层黑色霉层，严重影响寄主植物叶片的光合作用、呼吸作用以及蒸腾作用，降低了产品的产量和质量。此外，成虫和若虫分泌大量白色蜡粉、蜡丝，严重影响了花卉及绿化树木的观赏价值。如双钩巢粉在入侵我国香港仅3年后，就对柑橘类果树以及观赏植物杜鹃产生严重危害；而在海南，入侵不足1年便对番荔枝、番石榴、柑橘、油梨、椰子、槟榔、榄仁树等的生长发育产生了极大的不利影响，对我国观赏植物及果树苗木的出口贸易构成了严重威胁。

双钩巢粉虱原产于南美洲，已在佛罗里达、夏威夷、百慕大和香港定居。1996年在香港发现时，仅危害几种植物，且发生量很低，但3年后就使柑橘类和杜鹃的生产遭受重创。我国于2006年9月在海南省三亚市和文昌市首次发现双钩巢粉虱为害椰子，2007年8月在广西省南宁市发现其危害柑橘，2008年在广东省广州市的砂糖橘和柚子上发现其成虫和若虫的危害；截止2009年，双钩巢粉虱已在海南省的18个县市有不同程度的发生，并对20科29属37种植物产生不同程度的危害；其中，番荔枝、番石榴、椰子、槟榔、油梨、柑桔等受害最为严重。双钩巢粉虱是传入我国的另一种外来入侵害虫，鉴于其目前仅在我国香港、广东、广西、海南发现，而且一旦发生即可造成严重危害，并在我国具有进一步扩散和蔓延的趋势。而人为传播是双钩巢粉虱扩散蔓延的主要方式，因此加强对双钩巢粉虱的检疫和监测检测是杜绝其进一步传播扩散的根本途径。

双钩巢粉虱体型微小，雌性成虫体长0.96-1.11mm，雄性个体稍小；卵长0.26-0.31mm，淡黄色，半透明；初孵若虫体长0.37-0.42mm，鲜黄色，具淡黄白色区域；卵及初孵若虫肉眼均难以发现。而加强检疫和监测检测必需建立一套快速准确的分子检测方法。目前国际上用于双钩巢粉虱鉴定的方法主要有：1）形态特征鉴定；2）COI测序等。但目前国内针对双钩巢粉虱尚没有标准的检测方法。

COI技术曾用于鉴别双钩巢粉虱及其近缘种。mtDNA COI技术检测是利用通用型的引物，在DNA聚合酶的催化下，对目标DNA进行体外扩增，然后将PCR产物回收、纯化、测序，根据序列比对和系统发育树构建来判断检测结果。SS-COI PCR技术检测是在mtDNA COI技术的基础上发展起来的特异序列扩增区域标记，是利用特异性的引物，根据预期DNA条带的有无来判断检测结果，无需测序和序列比对，具有灵敏度高、特异性强、快速、简便且重现性和稳定性强等优点。

发明内容

本发明的目的为提供一对双钩巢粉虱特异性SS-COI引物。

本发明的另一目的是提供双钩巢粉虱SS-COI特异性片段。

本发明的另一目的为提供一种双钩巢粉虱的特异性快速PCR检测方法。

本发明的再一目的为提供一种双钩巢粉虱的特异性快速检测试剂盒。