[发明专利]瘦素检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物学和医学检验领域，具体涉及一种瘦素检测试剂盒。

背景技术

随着人类生活水平的提高，肥胖已成为当今世界的一个常见问题。肥胖症是摄食和能耗平衡机制的失调，可引起多种疾病，如II型糖尿病、高血压、高血脂和癌症等。瘦素常被指为肥胖蛋白，是肥胖基因的产物，瘦素作用于下丘脑，控制代谢、能耗和生殖系统，调节体内脂肪含量和糖代谢。尽在脂肪细胞中表达，循环瘦素水平与人体脂肪量呈正相关。瘦素在造血、肾上腺皮质功能中起作用，正常人血清瘦素水平较低，在动脉样硬化、生长激素不稳定、神经性厌食等会出现瘦素的变化。

瘦素检测试剂盒是瘦素的血清学诊断的一个常用手段，应用酶联免疫法的基本原理进行，所述的酶联免疫法也称为酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay），简称ELLSA,ELLSA过程包括抗原（抗体）吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体（抗原），再加相应酶标抗体（抗原），生成抗原（抗体）-待测抗体（抗原）-酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物，借助分光光度计的光吸收计算抗体（抗原）的量，待测抗体（抗原）的定量与有色产生成正比，瘦素检测试剂盒是现有技术中用于临床肥胖和糖尿病的辅助诊断手段之一，但是现有的瘦素酶标试剂的灵敏度和重复性较差。

发明内容

本发明的目的是提供一种瘦素检测试剂盒，该瘦素检测试剂盒的灵敏度高、重复性好。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种瘦素检测试剂盒，包括瘦素参考品，包被抗体微孔板，酶标记抗瘦素，洗涤液，显色液，终止液，所述的瘦素参考品为重组人瘦素多肽抗原，所述的包被抗体微孔板和酶标记抗瘦素为重组人瘦素多肽单克隆抗体。

本发明的瘦素检测试剂盒的检测原理为将重组人瘦素多肽单克隆抗体作为包被抗体微孔板，加待测血清样品，再加相应的酶标抗体，生成包被抗体-待测血清样品-酶标抗体的复合物，添加显色液显色后，再加终止液终止，并用洗涤液洗去残留液，测定待测血清样品的吸光值，与标准曲线比较即可得出待测血清样品中的瘦素含量。

本发明的瘦素检测试剂盒主要是根据酶联免疫法的原理来测定人血清、血浆和其他样品中的瘦素含量，可用于肥胖症和II型糖尿病的辅助诊断，本发明采用重组人瘦素多肽抗原为瘦素参考品，采用重组人瘦素多肽抗原单克隆抗体为包被抗体微孔板和酶标记抗瘦素，由上述重组人瘦素多肽抗原单克隆抗体构成的瘦素检测试剂盒，灵敏度高，重复性好，在测定瘦素含量的临床检测中发挥重要作用。

更进一步，本发明的瘦素检测试剂盒，其中所述的包被抗体微孔板为重组人瘦素多肽抗原单克隆抗体6A5,所述的酶标记抗瘦素为重组人瘦素多肽抗原单克隆抗体3F7。包被抗体和酶标抗体中的重组人瘦素多肽抗原单克隆抗体主要是根据单克隆抗体在96孔酶标板中的位置进行确定的。

所述的洗涤液是由28.8g的Na₂HPO₄·12H₂O、80g的NaCl、3.9g的NaH₂PO₄·2H₂O、50ml的Tween-20加入纯化水溶解定容至100000ml。

所述的显色液包括显色液A和显色液B，显色液A是由浓度为30%过氧化氢用柠檬酸缓冲液稀释至其体积的1000倍所得，显色液B是用含20%二甲基亚砜的柠檬酸缓冲液将四甲基联苯胺配制成0.4mg/ml所得。其中所述的柠檬酸缓冲液是由3.4g乙酸钠和5.2g柠檬酸溶于5000ml的纯化水所得。

所述的终止液为浓度2mol/L的硫酸溶液。

本发明的瘦素检测试剂盒，所述的瘦素参考品为重组人瘦素多肽抗原，该重组人瘦素多肽抗原采用本技术领域常规的合成方法所得，即是采用高保真PCR技术从人Cdna文库中的扩增瘦素全长基因，并克隆至pUL,DNA序列分析结果显示克隆的瘦素基因和文献报导的完全一致，亚克隆Leptin成熟肽编码区段至表达质粒PJW2，构建表达质粒pJL，转化E.coli DH5α，本发明的瘦素检测试剂盒中瘦素参考品可分为5个不同浓度的规格，分别为0ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、25ng/ml、50ng/ml，以便提高本发明的瘦素检测试剂盒的灵敏性和重复性。

所述的重组人瘦素多肽抗原单克隆抗体由以下步骤制备而成：

（1）以瘦素参考品免疫6-8周雌性Balb/c小鼠；

（2）取上述小鼠的免疫脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0，在浓度为50%的聚乙二醇作用下进行融合得杂交瘤细胞；