[发明专利]五重荧光PCR快速超敏检测试剂盒及其应用

权利要求书

1.在单个PCR反应容器中五重检测核酸提取液中靶核酸的实时PCR方法，所述靶核酸来自淋病奈瑟菌、沙眼衣原体、解脲支原体、人型支原体和生殖支原体，其包括，

（1）在所述单个PCR反应容器中混合核酸提取液、DNA聚合酶、dNTP、靶核酸引物对和靶核酸探针，其中所述探针标记有荧光基团和淬灭基团，而且各种探针标记的荧光基团的荧光检测波长互不相同，其中，

靶核酸引物对包括

ACCGTAACGTCTCTAAGTC，

GCAAGATTTCCGATTTGGC，

TGTCCATATCTTTGATACGAT，

CTCTGATATTTGAAGACTCTACA，

CTGCTCGTGAAGTATTACA，

GTACCATCTGGGAAAGTAC，

TGTGGTTTAATTTGAAGATACAT，

AGTCCTCAACTTAATGTTAGA，

AGGCAGTAATGTCAATCACA，和

GGCTTTATCATTGGCAAACG，

靶核酸探针包括：

CAGACATCACGCACCGAAGCAT，

CCAAGCCGAGTCTACAGTTATAGGTCA，

ACCAACCATTGTATCTACACCTTCCATA，

CCACTCTTGACATCCTTCGCATA，和

CCATTCGCATCCAACTTCACCTCT；

（2）进行PCR反应，并实时检测不同波长的荧光；和，

（3）根据荧光检测结果计算出的Ct值判断是否有靶核酸存在于样品中。

2.五重检测样品中淋病奈瑟菌、沙眼衣原体、解脲支原体、人型支原体和生殖支原体的方法，其包括，

（A）提取样品中的核酸，获得核酸提取液；和，

（B）对核酸提取液实施权利要求1所述的在单个PCR反应容器中五重检测样品中靶核酸的实时PCR方法。

3.权利要求1或2所述的方法，其是非诊断方法。

4.权利要求1所述的方法，其中各种探针标记有不同的荧光基团，优选荧光基团是FAM、VIC、NED、Texas Red和CY5。

5.权利要求1所述的方法，其中PCR反应的每个循环的条件为94℃10秒、55℃15秒以及65℃45秒。

6.权利要求1所述的方法，其中每种靶核酸探针在在所述单个PCR反应容器中的浓度大于5pmol/ml，优选为6~12pmol/ml，更优选为7~10pmol/ml，最优选为8pmol/ml。

7.权利要求2所述的方法，其中提取样品中的核酸是采用磁珠提取法提取的。

8.权利要求7所述的方法，其中提样试品中的核酸的过程是：向样品加入核酸萃取液（优选核酸萃取液包含异硫氰酸胍、乙二胺四乙酸钠、吐温-20、高氯酸钠、乙醇和pH缓冲液（如，Tris-HCl）），保温后加入磁珠，混合均匀后，施加磁场后，弃去其中液体，然后洗涤（优选洗涤两次，更优选其中第一次洗涤所用的洗涤液包含高氯酸钠和乙醇，也更优选其中第二次洗涤所用的洗涤液包含乙醇)，并洗脱（优选洗脱所用的洗脱液包含pH缓冲液（如，Tris-HCl））。