[发明专利]一种判定狼山鸡中B2血型的方法

说明书

技术领域

本发明涉及动物育种学、分子遗传学和分子生物学领域。

背景技术

由于B2血型类别与鸡的抗病力、生产性能具有密切联系，在遗传育种工作中具有较好的参考价值并且已应用于生产实践中。目前，大多数对于家禽血型的确定均采用免疫学方法。由于鸡血型系统多而复杂、血清中自然抗体弱，不易被检出，且特异性的抗血清制备技术比较复杂使得一些地方鸡品种的血型难以确定。然而，分子标记技术具有特异性高、操作相对简单等优势，能解决传统技术上的存在问题，可以实现对血型的快速、准确判定。应用分子标记进行血型判定将为鸡血型的判定打开一个新局面。由于微卫星DNA具有高度的个体专一性和多态性，使得微卫星DNA标记技术能有效反映群体内和群体间的遗传变异，是分析畜禽遗传多样性最理想的分子标记。国外有相关研究表明鸡MHC基因的多态性与血型有一定的关联，其中B血型由MHC基因的Ⅰ、Ⅳ区共同决定，可以利LEI0258和MCW0371位点对B类血型进行分型，但是传统的凝胶（琼脂和聚丙烯酰胺等）PCR产物分离粗糙，可靠性、重复性差，影响了这两个位点的实际应用；另外，国内鸡的育种多为现场育种，分子标记技术无法进入现场，目前，急需一种现场简单的血型判定方法，来提高育种现场中血型分型的准确性和可靠性，从而加速鸡抗病育种进展。

发明内容

本发明的目的是运用简单分子标记技术和红血球凝聚反应判定狼山鸡B2血型。

本发明的技术方案是：利用荧光标记微卫星分型技术分析狼山鸡MHC基因的两个座位MHC-Ⅰ和MHC-Ⅳ遗传多态性，根据等位基因大小对狼山鸡进行血型分型。

首先根据GeneBank中MHC基因(AL023516)序列，经Primer 3设计特异性较好的PCR引物，

MCW0371F：CTGCTCCGAGCTGTAATCCTG（SEQ ID NO.1）

MCW0371R：TTTCATGGCATCCTAAGATG（SEQ ID NO.2）

LEI0258F：CACGCAGCAGAACTTGGTAAGG（SEQ ID NO.3）

LEI0258R：AGCTGTGCTCAGTCCTCAGTGC（SEQ ID NO.4）

进行扩增条件的优化，PCR产物送生物公司进行分型分析。通过两个微卫星位点MCW0371和LEI0258的等位基因片段大小进行血型初步判定，如片段大小分别为261（MCW0371）和206（LEI0258），则为B2血型。选取血型初步判定为B2的供体，然后通过同种免疫、纯化等步骤制备B2血型特异性抗体血清，最后根据红血球凝集反应结果迅速判别出B2血型个体。

本发明还公开了狼山鸡MHC基因中MHC-Ⅰ和MHC-Ⅳ作为地方鸡种血型判定分子标记的应用。

附图说明

图1狼山鸡MCW0371荧光标记微卫星测序结果。

图2狼山鸡LEI0258荧光标记微卫星测序结果。

具体实施方式

1.1采集血样

狼山鸡基础群中翅静脉采血2ml，酚/氯仿法提取DNA，-20℃保存备用。

1.2引物设计

根据GeneBank中MHC基因(AL023516)序列，经Primer 3设计两对特异性较好的PCR引物，每对引物的上游引物5’端分别用荧光染料进行标记，引物避光保存。引物序列分别为：

表1荧光标记微卫星引物信息及最终反应条件

1.3PCR扩增和检测

PCR扩增总体积为20μL：1μLDNA模板（100ng/μL），2μL10×PCR Buffer，1.5μLdNTP（10m mol/L），上下游引物各1μL（10p mol/μL），Taq酶为0.2μL（5U/μL），ddH2O13.3μL。PCR扩增程序：95℃预变性5min，94℃变性40s，适宜退火温度40s，72℃延伸40s，35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存备用。经变性液处理后经10%聚丙烯酰胺电泳检测，银染并初步判型。

1.4荧光PCR产物ABI-3730XL DNA Analyzer全自动测序仪检测