[发明专利]在动物细胞或动物组织中表达外源基因的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种表达外源基因的方法，尤其涉及一种将外源基因导入到动物细胞或动物组织中并进行表达的方法，属于基因治疗领域。

背景技术

基因治疗自从1990年成功应用于SCID-X1患者的治疗至今已经有二十几年，一直以来基因治疗的研究的很大的侧重点在于基因转移载体的选择。由于将外源基因呈递到机体内的真核细胞中并表达的工作基本上是需要病毒载体来完成的，所以各种病毒载体在临床基因治疗中的选择和应用，在这些年来也是一个研究的重点，其中腺相关病毒载体（adeno-associated virus，AAV）是最近研究中最为成功的，但同时也存在一些问题。

目前，国内外关于基因治疗载体的选择问题开始偏向于杆状病毒载体，其中，最常用的是杆状病毒载体是Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus（AcMNPV）；它是一类专一性感染节肢动物的大型杆状包膜病毒，90-180Kb之间的环状双链DNA基因组包装在杆状衣壳内。由于近年来关于其研究越来越多并且越来越深入，加之其操作安全方便，在用于各种外源基因的表达并作为一种新型的基因治疗载体方面受到高度重视（Cory and Bishop,1997,Molecular Biotechnology,303-313）。有些早期初步探索中阐述有一些杆状病毒作为基因转移表达载体在哺乳动物细胞中作用的困难和缺点（Sandig et al.,1996,Journal of Molecular Medicine,205-212），但是在最近的研究中发现杆状病毒作为一种新型的哺乳动物细胞基因转移载体具有过去所采用的一些载体所不具备的特点，如：重组杆状病毒构建方便，易于大规模体外培养；外源基因容量大；感染哺乳动物细胞后不具备细胞毒性，安全性好，不会整合到细胞的基因组中，不会进行病毒DNA复制，其自身启动子在哺乳动物细胞内没有活性等。然而，用AcMNPV做为哺乳动物的外源基因呈递（基因治疗）的载体存在着非常难以克服的困难，即动物血液中的补体成分能够灭活AcMNPV病毒粒子，使外源基因导入哺乳动物细胞的效率非常低，由此失去实用价值（Sandig et al.,1996,Hum.Gene Ther.7:1937-1945；Hofmann and Strauss,1998，Gene Ther.5:531-536）。上述问题限制了杆状病毒AcMNPV在基因治疗中的应用范围，使其应用范围基本限于哺乳动物细胞，而不能用于生物个体的应用。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种将外源基因导入哺乳动物细胞或生物个体的各个组织中进行基因呈递的家蚕杆状病毒载体；

本发明的目的之二是提供一种构建所述基因呈递的家蚕杆状病毒载体的方法；

本发明的目的之三是提供一种在动物细胞或动物组织中表达外源基因的方法。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

一种将外源基因导入哺乳动物细胞或生物个体的组织中进行基因呈递的家蚕杆状病毒载体，包括骨架载体以及重组到骨架载体上的外源基因的表达盒；

所述骨架载体是家蚕杆状病毒BmNPV DNA；

所述外源基因的表达盒由启动子、外源基因和终止子组成；其中，所述启动子是哺乳动物启动子，所述哺乳动物启动子可以是CMV启动子、人巨细胞病毒早期启动子(CMV-IE)、人延伸因子1-亚基启动子、Rous肉瘤长末端重复序列、人leukosialin基因启动子、鼠3-磷酸甘油激酶l(PGKI)基因启动子、人泛素蛋白(ubiquitin)C基因启动子、由鸡β-肌动蛋白启动子和CMV增强子序列构成的杂合启动子或鼠乳房瘤病毒(MMTV)启动子等，优选为CMV启动子（其核苷酸序列为SEQ ID No.3所示）或CAG启动子；

所述的终止子优选是SV40-polyA尾终止子（其核苷酸序列为SEQ ID No.4所示）。

所述的外源基因可以是报告基因（例如，可以是绿色荧光蛋白EGFP基因或荧光素酶报告基因（SEQ ID No.2））、抗原基因、治疗遗传病用的相关基因、抑癌基因、其它功能基因或RNAi等。

本发明提供了一种将外源基因导入哺乳动物细胞或生物个体的组织中进行基因呈递的家蚕杆状病毒载体的构建方法，该方法包括：

（1）将外源基因的表达盒克隆到转移载体上，构建得到含有外源基因的重组转移载体；

（2）将所构建的含有外源基因的重组转移载体与杆状病毒共转染昆虫细胞进行同源重组，即得。