[发明专利]同时鉴别6种鸡呼吸道病病毒的GeXP快速检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种同时鉴别6种鸡呼吸道病病毒的GeXP快速检测试剂盒。

背景技术

H5、H7和H9亚型禽流感、新城疫、传染性支气管炎和传染性喉气管炎是严重危害鸡的6种主要病毒性呼吸道传染性疾病。这些传染病可感染不同年龄鸡群，具有较高的发病率和死亡率，其临床症状十分相似。鉴别诊断这些呼吸道疾病的传统常规方法，主要包括病原分离鉴定和血清学试验等，但这些方法常受临床病料新鲜度、污染程度或病程的限制，操作也十分繁琐费时，对多重混合感染的鉴别诊断就更为困难。近年来，随着分子生物学的发展，PCR技术已被广泛应用于这些呼吸道病的检测。但基于常规PCR技术建立的多重PCR检测技术，需几对引物组合在一起同时竞争地扩增，引物之间会产生相互干扰，多增加一对引物，敏感性就越低。PCR产物需要通过琼脂糖电泳才可观察结果，该电泳难以区分50bp-100bp以内的条带，一般只可做到2-4重PCR，难以做到高通量检测。多重荧光PCR一般只检测到3重，由于探针要标记不同发光波长的荧光基团，如标记太多的荧光基团，相互会产生干扰，因此，也只能检测到2-4重。由于在多重PCR反应体系中同时存在几对引物，使得形成复杂引物二聚体的概率大大增加，同时检测的目的基因数量有限，使得多重PCR还达不到高通量快速检测和分析的目标。

GeXP系统(Gene Expression Profiler Genetic Analysis System)是美国BeckmanCoμLter公司研发的用于研究多基因表达定量分析的平台，由两部分组成：用于设计引物的GeXP eXpression Profiler软件和用于结果分析的GenomeLabTM GeXP Genetic Analysis System毛细管电泳仪，后者可清晰分离出相差7bp的相邻扩增片段。GeXP多重PCR扩增采用荧光标记通用引物和特异性嵌合引物（基因特异性引物末端连接通用引物序列）相结合引发多重体系扩增。PCR反应之初，先由正、反向嵌合引物的特异性序列以cDNA或DNA为模板启动PCR反应，分别扩增出通用引物的互补序列；再由反应体系中占主导地位的荧光标记通用引物，与其互补序列结合，引发后续扩增。PCR产物经GeXP毛细管电泳分离，含有荧光标记的PCR产物经GeXP检测窗口检测，依据检测片段与标准分子片段（DNA Size Standard,DSS）迁移时间时间计算出扩增片段的长度，根据片段大小区分不同的病原体，荧光信号强度代表该分离片段的扩增含量。

基于GeXP多重基因遗传分析系统的平台，可在同一个体系里对多达40个目的基因进行有效分析，关键在于设计的引物扩增效率高、特异性强，能达到同时鉴别检测的目的。目前，还没有基于GeXP系统的同时可检测家禽多种呼吸道病病毒的试剂或试剂盒。

发明内容

本发明的目的是提供一种鉴定或辅助鉴定家禽呼吸道病病毒的GeXP快速检测的试剂或试剂盒，含有如下七种PCR引物对中的七种、任意六种、任意五种、任意四种、任意三种、任意两种或任一种：鉴定或辅助鉴定禽流感病毒的PCR引物对A，鉴定或辅助鉴定H5亚型禽流感病毒的PCR引物对B，鉴定或辅助鉴定H7亚型禽流感病毒的PCR引物对C，鉴定或辅助鉴定H9亚型禽流感病毒的PCR引物对D，鉴定或辅助鉴定新城疫病毒的PCR引物对E，鉴定或辅助鉴定传染性支气管炎病毒的PCR引物对F和鉴定或辅助鉴定传染性喉气管炎病毒的PCR引物对G；

所述PCR引物对A由序列表序列1所示的单链DNA和序列表序列2所示的单链DNA组成；

所述PCR引物对B由序列表序列3所示的单链DNA和序列表序列4所示的单链DNA组成；

所述PCR引物对C由序列表序列5所示的单链DNA和序列表序列6所示的单链DNA组成；

所述PCR引物对D由序列表序列7所示的单链DNA和序列表序列8所示的单链DNA组成；

所述PCR引物对E由序列表序列9所示的单链DNA和序列表序列10所示的单链DNA组成；

所述PCR引物对F由序列表序列11所示的单链DNA和序列表序列12所示的单链DNA组成；

所述PCR引物对G由序列表序列13所示的单链DNA和序列表序列14所示的单链DNA组成。

在上述试剂或试剂盒中，所述PCR引物对A和/或B和/或C和/或D和/或E和/或F和/或G的每条单链DNA在PCR反应体系中的摩尔浓度相同；