[发明专利]生物检测技术及检测试剂盒

说明书

技术领域

生物检测技术及检测试剂盒属于分子诊断技术领域。 

背景技术

生物医药产业作为新兴的朝阳行业日益受到我国政府的高度重视。生物检测技术及检测试剂盒的研制技术属分子诊断技术，广泛应用于动物、肉制品、奶制品等方面的检测。 

分子诊断是当代医学发展的重要前沿领域之一，其核心技术是基因诊断，常规技术包括：聚合酶链式反应（PCR），DNA测序（DNA sequencing)，荧光原位杂交技术（FISH），DNA印迹技术（ DNA  blotting ），单核苷酸多态性（SNP），连接酶链反应（LCR），基因芯片技术（gene chip）。其中，PCR产品占据目前分子诊断的主要市场，基因芯片是分子诊断市场发展的主要趋势。PCR产品灵敏度高、特异性强、诊断期短，可进行定性、定量检测，应用广泛，为早期诊断、早期治疗提供了有效的帮助。基因芯片是分子生物学、微电子、计算机等多学科结合的结晶，综合了多种现代高精尖技术，被专家誉为分子诊断行业的终极产品。但其成本高、开发难度大，目前产品种类很少，只用于科研和药物筛选等用途。 

随着分子生物学技术的不断发展，目前已有多种检测方法和检测试剂盒用于这些传染病的检测。目前最常用的有PCR检测试剂盒、RT-PCR检测试剂盒、实时荧光定量PCR检测试剂盒、ELISA检测试剂盒、LAMP检测试剂盒等。 

PCR：英文全称：polymerase chain reaction，即：聚合酶链式反应。1985年，美国科学家Kary Mullis经过两年的努力，发明了PCR技术，并在Science杂志上发表了关于PCR技术的第一篇学术论文。从此，PCR技术得到了生命科学界的普遍认同。PCR检测方法具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究,还可用于疾病的诊断。 

RT-PCR：英文全称是reverse transcription PCR，即反转录PCR。它是聚合酶链式反应（PCR）的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。RT-PCR的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNA。RT-PCR广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种RNA的含量。 

酶联免疫吸附试验（ELISA）:英文全称是Enzyme Linked Immunosorbent Assay。是目前应用最广泛的病毒抗原及抗体的检测技术，已经建立了多种方法，如间接法、双抗体夹心法、捕获法和生物素亲和素法等。近年来，在传统ELISA方法的基础上，研究者们对其进一步改进并建立了膜酶免疫试验和微孔膜免疫试验。 

LAMP：Notorm T 等开发了一种新颖的恒温核酸扩增方法，即所谓的环一媒恒温扩增法(Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP)，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶(BstDNApolymemse)在恒温条件(65℃左右)保温几十分钟，即可完成核酸扩增反应，直接靠扩增副产物焦磷酸镁沉淀的浊度进行判断是否发生反应，肉眼也可观察到阳性反应管中的白色混浊物。因此，LAMP技术可用于病原微生物的现场快速检测及基层普及应用。 

环介导等温扩增反应(loop-mediated isothermal amplification) ，LAMP法是用一套四条特异性引物与靶基因的六个不同区域退火杂交，在具有链置换活性功能的DNA聚合酶的作用下实现等温条件下扩增DNA分子的核算扩增新技术。 

发明内容

本项目组根据国内外几种重大动物疫病猪大肠杆菌病、新城疫、高致病性蓝耳病、猪瘟、猪伪狂犬、猪圆环快速诊断与检测需求建立不同的检测方法。 

⑴PCR检测方法 

①RT- PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）即逆转录PCR，是将RNA的逆转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增反应（PCR）相结合的技术。