[发明专利]笼式通气搅拌生物反应器制备流感疫苗的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种应用生物反应器高密度培养制备流感疫苗的方法，特别是涉及一种笼式通气搅拌生物反应器制备流感疫苗的方法，属于生物技术领域。

背景技术

20世纪40年代，第一支流感病毒灭活疫苗在美国批准使用，但由于其制造工艺粗糙，接种后副反应极为严重。随后相继出现了减毒疫苗、裂解疫苗，DNA疫苗等。流感病毒属RNA病毒，分为甲、乙、丙3型。其中甲型及其亚型病毒是引起人类流感传播的主要型别，乙型病毒仅会引起局部小流行及散发，丙型主要侵犯婴幼儿造成散发病例。

目前，国内外大部分生产流感疫苗的企业主要是采用鸡胚作为流感病毒增殖基质进行流感疫苗生产，这种生产方式有很大的局限性：均存在对SPF鸡胚的依赖性，需要大量的鸡蛋，质量难于控制；方法难于标准化；存在外源病毒污染；生产用毒株需要特殊技术制备高产株；生产系统相对开放并涉及生物安全问题；原材料之间变异性大；需尽可能减少过敏性的卵清蛋白；生产规模难于扩大等。尤其是一旦大流行发生，很难在短期内选择出适应鸡胚生长的变异株，并且鸡胚的供应也是个问题。因此针对全球大流行的储备，许多国际机构都在研究新一代的细胞培养的流感疫苗。

全球最大的生物制药公司之一诺华(NYSE：NVS)在2007年6月13日宣布，欧盟已经批准其流感疫苗Optaflu上市。Optaflu是第一个由细胞培养而非鸡胚生产的疫苗，能够迅速扩大生产能力以应对大流行。Optaflu的上市标志着50年流感疫苗生产史最重大的创新之一。

诺华公司开发的Optaflu是世界上第一个由细胞培养产生的流感疫苗。该疫苗以MDCK狗肾上皮细胞产生，于2007年获得欧盟的批准。而在那时，市场上所有的流感疫苗是由鸡蛋制备而得。后者的制备工艺不但漫长而且死板，所以不能满足流感爆发的需求。为了提供更快更灵活的替代工艺，很多厂家都进行了替代工艺的研究。除了诺华以外，Baxter的Celvapan是另外一个被欧盟批准采用细胞培养制备的流感疫苗，该公司用Vero细胞非洲绿猴的肾上皮细胞模拟制备流感疫苗，获得成功。

国内流感疫苗生产企业，多是采用鸡胚生产流感疫苗。据报道有部分企业正在摸索改变流感疫苗的培养基质并能大规模生产的工艺技术。

公开号为CN1511587的中国发明专利申请给出了一种《Vero细胞流行性感冒纯化疫苗的制备方法及其应用》，在来源于非洲绿猴肾传代的Vero细胞上加入促病毒增殖因子后，分别感染流感甲₁、甲₃和乙型流感病毒，72小时后收集三型病毒，经冻融、切向流过滤去除细胞碎片澄清，超滤浓缩、β-丙内酯灭活、Sepharose4FF柱层析纯化，稀释三型病毒原液，再合并三型病毒液，加保护剂、防腐剂成半成品流感纯化疫苗，然后分装为成品以及对疫苗原液、半成品及成品的检测。这种生产方法采用了3L转瓶培养Vero细胞制备流感疫苗，虽然改变了培养基质，但操作程序繁杂，易污染，生产难以放大，成本高、批间差异大，质量难以控制等缺点。

公开号为CN 101062411的中国发明专利申请给出了一种《应用生物反应器大规模生产流感疫苗的方法》，其特征在于：将流感当年流行毒株在Vero细胞上进行适应传代，经传代适应的病毒毒种保存于-70℃以下待用；在生物反应器中加入微载体，接种Vero细胞，待Vero细胞生长至一定密度时接种上述流感毒种，使病毒在合适的条件下大量增殖，将收获的病毒液经灭活、浓缩、纯化及裂解，根据纯化的单价原液的血凝素含量，配制成三价流感疫苗半成品。这种生产方法解决了采用鸡胚生产流感疫苗所存在的外源病毒污染难以控制、副反应大、成本高、生产规模不易扩大的缺点，但所采用的生物反应器为固定床篮式搅拌反应器，载体是片状载体，这种培养工艺在技术上存在一定的缺点。在培养面积上过于局限，每克片状微载体的面积可达1200cm²，不能很好的进行大规模的高密度培养。吊篮式片状微载体培养可放大到40L左右。不利于工业化大规模生产。