[发明专利]笼式通气搅拌生物反应器制备流感疫苗的方法

权利要求书

1.一种笼式通气搅拌生物反应器制备流感疫苗的方法，其特征在于：将流感病毒流行株接种到Vero细胞无血清适应株，经过传代适应的毒种建立毒种库，保存于-70℃冰箱内；利用笼式通气搅拌生物反应器高密度微载体培养Vero细胞，接种流感病毒，流感病毒增殖高峰期时，连续收获病毒液；将收获的病毒液澄清、浓缩、纯化制备疫苗。

2.根据权利要求1所述的笼式通气搅拌生物反应器制备流感疫苗的方法，其特征在于：Vero细胞无血清适应传代有如下步骤：将低代次的Vero细胞用胰酶消化传代，加入无血清培养基，适应传代，用无血清培养基传5～8代，细胞形态及密度达到要求，建立无血清Vero细胞库。

3.根据权利要求1所述的笼式通气搅拌生物反应器制备流感疫苗的方法，其特征在于：流感病毒流行株接种Vero细胞无血清适应株及适应传代有如下步骤：将流感病毒流行株接种至9～11日龄鸡胚传代，传至1～2代，接种Vero细胞无血清适应株。

4.根据权利要求1所述的笼式通气搅拌生物反应器制备流感疫苗的方法，其特征在于：Vero细胞适应的流感毒种接种笼式通气搅拌生物反应器感染复数MOI为0.01～0.0000001。

5.根据权利要求1所述的笼式通气搅拌生物反应器制备流感疫苗的方法，其特征在于：笼式通气搅拌生物反应器微载体高密度培养Vero细胞，其步骤如下：

(1)取工作种子库Vero细胞，进行扩增传代达到生物反应器所需的细胞数量；

(2)细胞悬液与20g/L微载体混合，并通过连接装置，导入已处理完毕的生物反应器，调整Celligen参数，pH＝7.4、温度＝37℃、D O＝50、搅拌浆转数＝80转/分钟；

(3)反应器在上述条件下进行细胞培养，培养液为M199培养基和无血清培养基，培养5～6日，细胞密度达到1.0～1.5×10⁷/ml以上时感染病毒。

6.根据权利要求1所述的笼式通气搅拌生物反应器制备流感疫苗的方法，其特征在于：Vero细胞接种笼式通气搅拌生物反应器接种、灌流有如下步骤：

将已丰满单层的Vero细胞15瓶，用胰酶消化后接种生物反应器培养基为M199培养基；

接种第2天2个体积进行灌流，培养基为M199培养基；

接种第3天4个体积进行灌流，培养基为无血清培养基；

接种第4天4个体积进行灌流，培养基为无血清培养基；

接种第5天4个体积进行灌流，培养基为无血清培养基；

接种第6天3个体积进行灌流，培养基为无血清培养基；

接种第7天感染病毒。

7.根据权利要求1所述的笼式通气搅拌生物反应器制备流感疫苗的方法，其特征在于：笼式通气搅拌生物反应器流感病毒培养，有如下步骤：

取流感工作种子批毒种，迅速融化；

根据生物反应器中的总细胞数，决定病毒接种量，感染复数MOI为0.01～0.0000001；

将确定量的病毒与适量的无血清培养基混匀，并按终浓度20ug/ml加入胰蛋白酶；

降低反应器温度至33℃，pH调至7.4；

接种细胞后的第7天感染病毒(胰酶终浓度为20ug/ml)，接种后吸附3小时后，灌流24小时开始连续收获，每天按一个罐体积收获，72小时停止收获。(灌流培养基中胰酶终浓度为5ug/ml)。

8.根据权利要求1所述的笼式通气搅拌生物反应器制备流感疫苗的方法，其特征在于：生物反应器为美国NBS公司生产的笼式通气搅拌生物反应器，微载体为美国GE生产的Cytodex球状微载体，不限于Cytodex1微载体和Cytodex3微载体。