[发明专利]预防山羊葡萄球菌乳房炎的基因工程疫苗制备方法及应用

说明书

一、技术领域：

本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及一种预防山羊葡萄球菌乳房炎的基因工程疫苗制备方法及应用。

二、背景技术：

乳房炎是令产奶动物养殖者比较头疼的动物疫病之一，引起母畜产奶量和相应的奶制品质量下降，造成重大的经济损失。金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、链球菌是造成乳房感染，引起临床、亚临床乳房炎的主要致病菌。因金黄色葡萄球菌抵抗多种抗生素的抑制作用，非抗生素途径控制金黄色葡萄球菌感染引起乳房炎已显得十分重要。

传统乳房炎疫苗为上述致病菌的弱毒活疫苗或灭活疫苗，在生产实践中，对乳房炎的防治有一定作用。然而随着大规模集约化养殖的发展，人工致弱菌株存在着同源重组、自身毒力返强等潜在可能，而灭活疫苗也存在使用剂量大、免疫期短等不足，为提高传统疫苗的安全性与免疫保护力，具有高效、廉价的新型疫苗研制极其重要。

三、发明内容：

本发明的目的在于提供一种预防山羊葡萄球菌乳房炎的基因工程疫苗制备方法及应用，其更加安全稳定、制备简单、应用方便、价格低廉。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为 ：一种预防山羊葡萄球菌乳房

炎的基因工程疫苗制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）扩增目的基因ClfA、ClfA及Sbi；

2）构建pCI- Hla/ClfA-A/ Sbi-I-II真核重组表达载体；

3）建立免疫程序及评估免疫效果。

所述的将ClfA、ClfA及Sbi三种蛋白的基因功能性区域串联，制成多价核酸疫苗，免疫宿主，使其在宿主细胞内表达，宿主产生特异性抗体以达到预防金黄色葡萄球菌感染的目的。

所述的基因工程疫苗制备方法的具体步骤为：1）设计引物；2）制备模板；3）PCR扩增与回收目的基因；4）构建真核表达载体pCI- Hla/ClfA-A/ Sbi-I-II；5）建立免疫程序及评估免疫效果。

预防山羊葡萄球菌乳房炎的基因工程疫苗制备方法，其特征在于：

1）设计引物

根据Genebank上已经提交的ClfA、Hla及Sbi基因序列分别设计引物H1/H2、CA1/CA2和S1/S2，并加入相应的酶切位点：

H1: GCGCTAGCATGAAAACACGTATAG                NheI

H2: GCCTCGAGTTAATTTGTCATTTCTTCT              XhoI

CA1: GCCTCGAGGTAGCTGCAGATG                  XhoI

CA2: GCGAATTCCTCATCAGGTTGTTCAGGA            EcoRI

S1: GCGAATTCACAAACAACTCAAAACAACTAC          EcoRI

S2: GCTCTAGAATTTTGACGTTCTTTAGCTT             XbaI

2）制备模板

提取DNA模板所用的金黄色葡萄球菌分离自患临床乳房炎的奶山羊乳样，均匀涂抹乳样于血琼脂平板，37℃温箱中过夜培养，挑取溶血性菌于显微镜下观察细菌形态，确定为金黄色葡萄球菌后再挑取菌落于5 mL LB液体培养基中，37℃摇床中培养过夜，取1 mL菌液，用细菌基因组DNA快速抽提试剂盒提取金黄色葡萄球菌基因组DNA， -20℃保存备用；

3）PCR扩增与回收目的基因

（1）扩增目的基因Hla

反应体系（50 μL）：超纯水32 μL，10 × Taq Buffer 5 μL，dNTP Mixture 4 μL，MgCl₂ 4 μL，H1/H2各1 μL，模板2 μL，Taq酶1 μL，加样后充分混匀；

PCR程序：预变性94℃ 5 min；进入循环：变性94℃ 30 s，退火51.6℃ 30 s，延伸72℃ 1.5 min，共30个循环；最终延伸72℃ 10 min；

（2）扩增目的基因ClfA的A区

反应体系（50μL）：超纯水32 μL，10 × Taq Buffer 5 μL，dNTP Mixture 4 μL，MgCl₂ 4 μL，CA1/CA2各1 μL，模板2 μL，Taq酶1 μL，加样后充分混匀；