[发明专利]预防山羊葡萄球菌乳房炎的基因工程疫苗制备方法及应用

权利要求书

1.一种预防山羊葡萄球菌乳房炎的基因工程疫苗制备方法，其特征

在于：包括以下步骤：

1）扩增目的基因ClfA、ClfA及Sbi；

2）构建pCI- Hla/ClfA-A/ Sbi-I-II真核重组表达载体；

3）建立免疫程序及评估免疫效果。

2.根据权利要求1所述的预防山羊葡萄球菌乳房炎的基因工程疫苗制备方法，其特征在于：所述的将ClfA、ClfA及Sbi三种蛋白的基因功能性区域串联，制成多价核酸疫苗，免疫宿主，使其在宿主细胞内表达，宿主产生特异性抗体以达到预防金黄色葡萄球菌感染的目的。

3.根据权利要求1所述的预防山羊葡萄球菌乳房炎的基因工程疫苗制备方法，其特征在于：所述的基因工程疫苗制备方法的具体步骤为：1）设计引物；2）制备模板；3）PCR扩增与回收目的基因；4）构建真核表达载体pCI- Hla/ClfA-A/ Sbi-I-II；5）建立免疫程序及评估免疫效果。

4.根据权利要求3预防山羊葡萄球菌乳房炎的基因工程疫苗制备方法，其特征在于：

1）设计引物

根据Genebank上已经提交的ClfA、Hla及Sbi基因序列分别设计引物H1/H2、CA1/CA2和S1/S2，并加入相应的酶切位点：

H1: GCGCTAGCATGAAAACACGTATAG                NheI

H2: GCCTCGAGTTAATTTGTCATTTCTTCT              XhoI

CA1: GCCTCGAGGTAGCTGCAGATG                  XhoI

CA2:GCGAATTCCTCATCAGGTTGTTCAGGA            EcoRI

S1:GCGAATTCACAAACAACTCAAAACAACTAC          EcoRI

S2: GCTCTAGAATTTTGACGTTCTTTAGCTT             XbaI

2）制备模板

提取DNA模板所用的金黄色葡萄球菌分离自患临床乳房炎的奶山羊乳样，均匀涂抹乳样于血琼脂平板，37℃温箱中过夜培养，挑取溶血性菌于显微镜下观察细菌形态，确定为金黄色葡萄球菌后再挑取菌落于5 mL LB液体培养基中，37℃摇床中培养过夜，取1 mL菌液，用细菌基因组DNA快速抽提试剂盒提取金黄色葡萄球菌基因组DNA， -20℃保存备用；

3）PCR扩增与回收目的基因

（1）扩增目的基因Hla

反应体系（50 μL）：超纯水32 μL，10 × Taq Buffer 5 μL，dNTP Mixture 4 μL，MgCl₂ 4 μL，H1/H2各1 μL，模板2 μL，Taq酶1 μL，加样后充分混匀；

PCR程序：预变性94℃ 5 min；进入循环：变性94℃ 30 s，退火51.6℃ 30 s，延伸72℃ 1.5 min，共30个循环；最终延伸72℃ 10 min；

（2）扩增目的基因ClfA的A区

反应体系（50μL）：超纯水32 μL，10 × Taq Buffer 5 μL，dNTP Mixture 4 μL，MgCl₂ 4 μL，CA1/CA2各1 μL，模板2 μL，Taq酶1 μL，加样后充分混匀；

PCR程序：预变性94℃ 5 min；进入循环：变性94℃ 30 s，退火52℃ 30 s，延伸72℃ 1.5 min，共30个循环；最终延伸72℃ 10 min；

（3）扩增目的基因Sbi的I区和II区

反应体系（50μL）：超纯水32 μL，10×Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture 4μL，MgCl₂ 4μL，S1/S2各1μL，模板2μL，Taq酶1μL，加样后充分混匀；

PCR程序：预变性94℃ 5min；进入循环：变性94℃ 30s，退火51℃ 30s，延伸72℃ 1min，共30个循环；最终延伸72℃ 10min；

（4）回收PCR扩增产物

胶回收试剂盒回收PCR扩增产物用， -20℃保存备用；

4）构建真核表达载体pCI- Hla/ClfA-A/ Sbi-I-II

（1）pCI-Hla重组载体的构建

用限制性内切酶Nhe I和Xho I分别对pCI、Hla在37 ℃温箱中酶切反应1 h，酶切产物经核酸电泳鉴定纯化后回收，然后将二者混合于16 ℃过夜连接，将连接产物转化入感受态细胞，在Amp⁺平板上37℃培养12 h后挑取阳性质粒做菌液PCR鉴定、双酶切鉴定和测序鉴定；

（2）pCI- Hla/ClfA-A重组载体的构建

用限制性内切酶Xho I和EcoR I分别对pCI-Hla、ClfA-A进行双酶切，方法同pCI-Hla重组载体的构建方法；

（3）pCI-Hla/ClfA-A/Sbi-I-II重组载体的构建

用限制性内切酶EcoR I和Xba I分别对pCI- Hla/ClfA-A、Sbi-I-II进行双酶切，方法同pCI-Hla重组载体的构建方法；

5）建立免疫程序及评估免疫效果

选12只14~16 g的小鼠分两组，每组6只，分别用pCI质粒和重组的pCI-Hla/ClfA-A/Sbi-I-II质粒以肌肉途径注射免疫，每三周免疫一次，最后一次免疫后第3周采集小鼠血清；

IgG水平测定：用原核表达的ClfA的A区蛋白包被96孔板，37 ℃孵育2 h,加入小鼠血清，37 ℃共孵育2 h，最后加入辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG的二抗37 ℃孵育1 h，酶标仪读取OD₄₅₀的值，结果表明pCI质粒免疫组的OD₄₅₀几乎为零，pCI-Hla/ClfA-A/Sbi-I-II质粒免疫组的OD₄₅₀平均为1.6，说明pCI-Hla/ClfA-A/Sbi-I-II质粒免疫组小鼠有较高的IgG水平；

IgG1和IgG2a水平测定：方法同IgG水平测定，pCI质粒免疫组的IgG1和IgG2a的OD₄₅₀均为零，而pCI-Hla/ClfA-A/Sbi-I-II质粒免疫组IgG1和IgG2a水平均在0.6~0.7之间，且IgG2a的量大于IgG1的量，说明经pCI-Hla/ClfA-A/Sbi-I-II质粒免疫的小鼠能产生较强的细胞免疫应答和体液免疫应答，并且细胞免疫应答强于体液免疫应答；

保护效应评估：用100 μL 1 × 10⁶ /ml的金黄色葡萄球菌分别感染pCI质粒免疫组小鼠、pCI-Hla/ClfA-A/Sbi-I-II质粒免疫组小鼠的乳腺，24 h后取小鼠的乳腺组织，称重、捣碎后，将组织匀浆涂抹在琼脂平板上，37℃培养12 h后，计菌落数，pCI质粒免疫组小鼠乳腺载菌量平均为3×10⁷/g，pCI-Hla/ClfA-A/Sbi-I-II质粒免疫组小鼠乳腺载菌量平均为1.2×10¹⁰/g，说明pCI-Hla/ClfA-A/Sbi-I-II质粒免疫能对小鼠产生较强的免疫保护作用。

5.根据权利要求1所述的基因工程疫苗在预防山羊葡萄球菌乳房炎中的应用。