[发明专利]一管式共用引物法检测同一突变位点不同突变类型

说明书

 

技术领域

一管式共用引物法检测同一突变位点不同突变类型，此发明可以应用于环介导等温扩增检测技术领域，结核杆菌、乙型肝炎病毒、HIV病毒、肿瘤耐药等检测。

背景技术

环介导等温扩增法( loop-mediated isothermal amplification , LAMP)是2000 年开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6 个区域设计4 种特异引物，利用一种链置换DNA 聚合酶在等温条件(63 ℃左右) 保温30－60分钟，即可完成核酸扩增反应。与常规PCR相比，不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程。LAMP 是一种全新的核酸扩增方法，具有简单、快速、特异性强的特点。该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能优于PCR技术，不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测，检测成本远低于荧光定量PCR。

目前在行业应用最广范的耐药检测是药敏实验和基因芯片技术，药敏实验耗时太长，基因芯片虽然能实现高通量检测但是制备成本及检测费用均较昂贵，灵敏度低，不宜大面积推广。因此急需一种检测成本低、灵敏度高切实可行的方法。

发明内容

本发明的目的是：提供一种同时一管式检测同一突变位点不同突变类型的环介导等温扩增检测方法。

本发明的技术方案是：该方法可以在同一个核酸检测反应管中同时检测同一个突变位点的不同突变碱基。LAMP设计需要4-6个引物，通过在环介导等温扩增检测试剂盒探针设计，对于同一突变点的不同突变类型，只改变覆盖突变点处的引物，覆盖其它位点的引物不变（加入数量也不变），这样保证了，突变点的引物与其它点位的引物之间不发生交叉反应，只需要验证覆盖同一突变点不同突变类型处的引物之间是否发生交叉反应即可，那么覆盖此处这引物只有一到两个碱基不同，也不会发生反应，这就是本检测方式的理论基础。

 实施例1：

    结核分支杆菌耐利福平（RFP）药物核苷酸526点突变有如下几种情况：

如果采用现有环介导等温扩增检测技术，需要六个试管检测出这六种突变方式之一，可以确定526耐药，采用基因芯片检测也需要有六个对应的检测点才能检测到不同的突变形式，但假定他们在耐药性级别是一样的，哪么就不需要检测出他们具体是哪种突变类型，只需要检测有以上基因存在即可，此点即耐药，正是基于此，本专利技术采用环介导等温扩增技术，本专利技术针对526点位6种突变类型设计了覆盖对应突变点的6种不同引物（如下所示），这6条引物之间，只有1到2个碱基不同，因此之间不会发生交叉反应，覆盖其它点位的引物（共用引物）和覆盖突变点的每条引物都是搭配的，他们可以单独在一个管中反应检测确定不同的突变点，也就是说每条突变点引物和共用引物不可能发生交叉反应，共用引物之间当然也不存在交叉反应，这都是在在设计时就已确定了，这样所有的反应环节不可能存在交叉反应，因此将他们加入一个管反应是没有问题的，只要存在一个突变以上位点，对应的引物和共用引物一起就会和结核DNA相结合，发生反应，其它突变引物不参与其中的反应，这样就可以确定526存在突变，是耐药的，这样即可达到由一个反应管同时检测多种突变的目的。我们将以上的方法定义为：LAMP一管式共用引物法检测同一突变点的不同突变类型。

    那么如果和一管只检测一个突变类型对比最佳的引物加入量是什么样的呢？当然不是简单的只将6个管液体混合，每条共用引物的加入量是不变的（和一管只检一个突变类型是一样的），DNA模板的量也不变，突变引物每一条和单管检一个突变类型也是相同的，也就是说无论DNA存在以上哪一个突变类型或哪几个突变类型，他们都会去与对应的突变引物及共用引物相结合。但是反应效率和灵敏是不同的，我们假定526DNA中分别存在以上6种突变，且含量相同，但是每种突变的浓度都低于LAMP最低检测线，这样如果分别检测就不会检到突变基因，但是将他们一管式检测，相当于总反应体积基本未变的情况下，有效的突变基因浓度提高了近6倍，这样就完全有可能检到突变，因此本技术不仅是降低成本，更重要的是可以极大的提高对多突变类型同时存在的检测灵敏度。

针对6种突变方式设计引物如下：

六个突变位点对应引物：

引物1、TGACCTACAAGCGCCGACT

引物2、TGACCGACAAGCGCCGACT

引物3、TGACCCTCAAGCGCCGACT

引物4、TGACCCCCAAGCGCCGACT