[发明专利]聚乙二醇化壳聚糖在作为核酸载体中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种聚乙二醇化壳聚糖的新用途，特别涉及O-羟乙基壳聚糖体在作为核酸载体中的应用。

背景技术

基因治疗是指运用DNA技术来实现治疗人类疾病的一种治疗方法。近年来，基因治疗的发展使得一些遗传性疾病或癌症的治愈成为可能。目前，应用最为广泛的用于基因治疗的载体就是病毒载体，如逆转录病毒，腺病毒，痘苗病毒等。但这些病毒类载体在临床应用中存在着很大的安全隐患。因此，寻找安全、有效、无免疫原性的非病毒类载体就成为目前关注的热点之一。

非病毒载体主要分为阳离子聚合物和阳离子脂质体两大类。阳离子聚合物具有如下优点：（1）提供与DNA自组装的动力，有利于保护DNA免受降解；（2）压缩DNA成为比DNA体积小的复合物颗粒，有利于进入细胞；（3）使复合物颗粒之间产生静电排斥作用，稳定复合物；（4）与细胞膜产生静电吸附作用，促进复合物内吞。尽管已有阳离子聚合物聚乙烯亚胺（PEI）应用于体内外转染的应用出现，但是PEI与DNA所形成的复合物由于带有过剩的正电荷，会给细胞带来急性及延迟的毒副作用，而且该转染试剂的转染效率也不够高，这些缺点大大影响了其在临床上的应用。

为解决上述问题，急需一种在转染效率、细胞毒性方面均有改进的非病毒类转染载体的出现。

发明内容

本发明的目的是提供一种聚乙二醇化壳聚糖的新用途。

本发明所提供的聚乙二醇化壳聚糖的新用途，具体为如式Ⅰ所示的聚乙二醇化壳聚糖在制备核酸载体中的应用，

式Ⅰ

所述式Ⅰ中，n为10-20的整数，x为3-7的整数，y为2-10的整数。

当然，如所述式Ⅰ所示的聚乙二醇化壳聚糖在作为核酸载体中的应用也属于本发明的保护范围。

在上述两应用中，所述载体运载所述核酸进入宿主细胞。

本发明的另一个目的是提供一种体外转染细胞的方法。

本发明所提供的体外转染细胞的方法具体可包括如下步骤：

（1）将如所述式Ⅰ所示的聚乙二醇化壳聚糖与待转染核酸按照质量比为0.1-100：1的比例混合形成复合物；

（2）将步骤（1）所得的复合物导入目的细胞。

在上述方法中，所述细胞具体为动物来源的细胞，当然也包括人来源的细胞。在本发明的一个实施例中，所述细胞具体为HEK293细胞（人胚肾细胞）、NIH3T3细胞（小鼠胚胎成纤维细胞）和HeLa细胞（人宫颈癌细胞）。

如所述式Ⅰ所示的聚乙二醇化壳聚糖与核酸所形成的复合物在制备治疗相应疾病的产品中的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用中，所述相应疾病为用所述核酸进行基因治疗的疾病；所述复合物中，所述聚乙二醇化壳聚糖与所述核酸的质量比为0.1-100：1（如10：1）。

所述聚乙二醇化壳聚糖与核酸所形成的复合物的制备方法也属于本发明的保护范围。

该方法可包括将所述如式Ⅰ所示的聚乙二醇化壳聚糖与核酸按照质量比为0.1-100：1（如10：1）的比例混合后并孵育的步骤。

在上述各应用及方法中，所述式Ⅰ中，x均具体可为5，y均具体可为5，n均具体可为8。

在上述所述聚乙二醇化壳聚糖与核酸所形成的复合物的制备方法中，所述孵育的温度可为20-25℃，所述孵育的时间可为10-30分钟

具体的，所述复合物均可按照包括如下步骤的方法制备：

（1）将所述如式Ⅰ所示的聚乙二醇化壳聚糖的水溶液用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤，获得无菌的聚乙二醇化壳聚糖水溶液；

（2）将步骤（1）获得的聚乙二醇化壳聚糖水溶液与无菌的核酸水溶液，按照所述聚乙二醇化壳聚糖与所述核酸的质量比为0.1-100：1的比例混合，获得混合溶液；

（3）将步骤（2）所得的混合溶液置于20-25℃孵育10-30分钟，获得所述如式Ⅰ所示的聚乙二醇化壳聚糖与核酸所形成的复合物。

在本发明的一个实施例中，步骤（2）中所述聚乙二醇化壳聚糖与所述核酸的质量比具体为10：1；步骤（3）中进行孵育的具体温度为室温（25℃），孵育的具体时间为10分钟。

由上述方法制备得到的所述复合物也属于本发明的保护范围。

所述如式Ⅰ所示的聚乙二醇化壳聚糖与核酸所形成的复合物的颗粒直径为20-100nm，表面电位为+5mV至+60mV。

在转染过程中，表面带正电的所述复合物与细胞表面带负电的蛋白多糖相互作用，并通过内吞作用进入细胞。