[发明专利]一种3’-cDNA展示方法无效
| 申请号： | 201210382040.8 | 申请日： | 2012-10-10 |
| 公开（公告）号： | CN102994632A | 公开（公告）日： | 2013-03-27 |
| 发明（设计）人： | 贾定洪;郑林用;彭卫红;甘炳成;黄忠乾;谭伟;王波;谢丽源 | 申请（专利权）人： | 四川省农业科学院土壤肥料研究所 |
| 主分类号： | C12Q1/68 | 分类号： | C12Q1/68 |
| 代理公司： | 北京众合诚成知识产权代理有限公司 11246 | 代理人： | 龚燮英 |
| 地址： | 610066 四*** | 国省代码： | 四川;51 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 cdna 展示 方法 | ||
1.一种3’-cDNA展示方法，其特征在于，该方法的主要步骤包括：
(1)以总RNA 或者mRNA 为模板，以设计合成的Oligo (dT)18V引物通过反转录合成cDNA双链；
(2)将步骤(1)得到产物通过TaqⅠ内切酶进行酶切；
(3)将步骤(2)产物与设计合成的“Y”形接头用T4连接酶连接；
(4)以Oligo (dT)18V及TaqⅠ“Y”形接头序列设计引物进行PCR扩增；
(5)变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。
2.如权利要求1所述的3’-cDNA展示方法，其特征在于，所述变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测方法进一步包括：
(1)以总RNA或者mRNA为模板，以设计合成的Oligo (dT)18V引物通过反转录合成cDNA双链；
(2)将步骤(1)得到产物通过TaqⅠ内切酶进行酶切，得到两端具有粘性末端的cDNA片段及一端为粘性末端另一端为PolyA末端的cDNA片段；
(3)将步骤(2)产物与设计合成的“Y”形接头用T4连接酶连接，得到两种产物，一种是两端都连接上“Y”形接头的片段，另一种是一端连接上“Y”形接头一端具有PolyA末端的cDNA片段；
(4)以Oligo (dT)18V及TaqⅠ“Y”形接头序列设计引物进行PCR扩增，其结果是：两端都连接上“Y”形接头的片段在PCR扩增中因其片段两尾的互补序列而形成锅柄状结构，扩增受到抑制；而一端连接上“Y”形接头一端具有PolyA末端的cDNA片段在扩增中得到正常指数扩增。
3.如权利要求1所述的3’-cDNA展示方法，其特征在于，所述展示方法应用“Y”形接头与酶切片段连接，抑制非PolyA末端的cDNA扩增，让具有“Y”形接头及PolyA末端的cDNA得到指数扩增，排除了非PolyA末端cDNA的干扰，从而只扩增cDNA 3’末端序列。
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