[发明专利]一种检测WT1基因mRNA表达量的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域的荧光定量PCR技术，具体涉及一种检测WT1基因mRNA表达量的试剂盒。

背景技术

急性髓细胞性白血病（Acute myeloid leukemia，AML）是一种临床分子异质性恶性克隆性疾病，是急性白血病最常见的类型，在美国每年有超过11,900新发病例，AML患者大多是中老年人。大约一半的成年AML患者缺乏染色体畸变，虽然这些患者有一个较长的预后期，但是只有40%能长期存活。微小残留病（Minimal Residual Desease，MRD）是ALL患者经过治疗，并按同前所确定的疗效标准达到临床完全缓解状态后，体内残留微量白血病细胞的状态。MRD是ALL的重要的独立预后指标。已经证实患儿体内的MRD在ALL的疗效评价、预后判断和复发监测以及造血干细胞移植时净化移植物等方面均有十分重要的意义。

WTl（Wilms’tumour gene 1）基因是从Wilm’s tumour细胞的染色体中分离出来的Wilm’s瘤基因，定位于染色体11p13断臂上，由10个外显子组成，是一种能编码锌指结构转录因子的抑癌基因。近年来许多学者发现WT1基因作为致癌基因在各种白血病（除慢性粒细胞白血病慢性期）及其他肿瘤中被高表达，特别是AML。WTl基因与造血系统肿瘤发病有关，几乎所有的白血病原始细胞都持续表达WT1基因，WT1基因的主要功能是参与调控细胞周期和细胞凋亡。研究表明，WT1基因表达水平上调或WT1基因突变与AML患者的临床预后和治疗效果密切相关。WTl基因约在80％的初诊AML和ALL患者中有过度表达，在发生WTl基因突变的一些急性白血病者中，WTl基因的表达量会更高，现已被公认为泛白血病标记。WT1蛋白能激活转录激活因子或是抑制因子，大约一半的成人AML患者在诊断上缺乏同源性染色体畸变，虽然这些患者预后中等，但仅仅只有40%是长期存活的。因而需要一种特异的分子标志物来提高诊断、预测预后以及指导治疗。对于接受常规化疗的患者，WTl基因可以作为一个独立的MRD监测及预后提示指标。

目前可用于WT1基因定量表达的方法有探针杂交法、基因芯片法、质谱法、基因测序法等。探针杂交法假阳性率较高；基因芯片法成本高、制备方法繁琐；质谱法难以在普通医疗机构开展；基因测序法虽敏感性和特异性高，但价格比较昂贵，而且操作较繁琐，耗时较长。荧光PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）检测WT1基因定量表达可高通量完成临床样品检测，且特异性和敏感性都很高。实时荧光定量PCR技术实现了PCR从定性到真正意义的定量的飞跃，为人类疾病基因的定量检测提供了一个行之有效的检测工具，与普通PCR相比具有特异性增强、灵敏度提高和检测快速、降低了污染等特点，但目前尚未有荧光定量PCR方法检测急性髓细胞性白血病中WT1基因的相关报道。

发明内容

为了解决现有技术的问题，本发明实施例提供了一种检测WT1基因mRNA表达量的试剂盒。所述技术方案如下：

本发明实施例提供了一种检测WT1基因mRNA表达量的试剂盒，包括检测用引物、荧光探针、cDNA第一链合成试剂、荧光定量PCR混合液、阴性对照和阳性对照，所述检测用引物、荧光探针包括WT1基因引物、内参基因ABL引物及Taqman荧光探针，其中：

WT1基因上游引物序列如序列表中SEQ ID NO:1所示；

WT1基因下游引物序列如序列表中SEQ ID NO:2所示；

WT1基因Taqman荧光探针如序列表中SEQ ID NO:3所示；

ABL基因上游引物序列如序列表中SEQ ID NO:4所示；

ABL基因下游引物序列如序列表中SEQ ID NO:5所示；

ABL基因Taqman荧光探针如序列表中SEQ ID NO:6所示；

所述cDNA第一链合成试剂含有MgC1₂、逆转录酶缓冲液、dNTPs、RNA酶抑制剂、Oligo(dT)₁₅、AMV逆转录酶和无RNase去离子水；所述荧光定量PCR混合液含有PCR预混合液、Mg²⁺、dNTPs、dUTP、Taq酶、UNG酶和无RNase去离子水。