[发明专利]一种检测外周血有核细胞胞内蛋白质的方法

说明书

发明领域

本发明涉及一种目标蛋白质的检测方法，属于细胞生物学领域。 

背景技术

外周血细胞中包含淋巴细胞、粒细胞等有核细胞和大量的红细胞。细胞免疫荧光标记结合荧光显微镜、流式细胞仪等设备的方法是对外周血有核细胞胞内蛋白质含量分析的方法之一。这种方法在抗体标记过程中，抗体识别容易受到外周血中残留红细胞的影响。通常情况下，对外周血有核细胞胞内蛋白质进行免疫荧光标记时会采用下面几种方法：1、采用特异性抗体分离出需要的有核细胞，再进行固定、标记。这种方法成本高，实验时间长。2、采用红细胞裂解液，去除红细胞，而后对有核细胞进行固定、标记。这种方法在裂解红细胞的同时可能会对有核细胞产生破坏，影响后续实验。由此可见如何有效去除红细胞是这种实验的关键问题之一。 

发明内容

针对现有技术不足，本发明要解决的技术问题是在外周血有核细胞固定之后，抗体标记之前能有效的去除外周血中的大量红细胞，实现快速、简单的对外周血有核细胞内蛋白质进行免疫荧光标记。 

该方法能够广泛的应用于医学诊断、蛋白质检测、分子生物学研究领域。 

尤其是本发明涉及一种检测外周血有核细胞胞内蛋白质的方法，包括如下步骤： 

1)在外周血样品中加入5倍体积固定液，室温作用30分钟； 

2)室温离心(500g)5分钟，去上清； 

3)加入洗液对细胞沉淀进行洗涤，室温条件下离心(500g)5分钟，去除上清，保留沉淀； 

4)加入5倍外周血样品体积的破膜剂，混匀细胞沉淀，室温作用15min； 

5)室温离心(500g)5分钟，去上清； 

6)加入洗液洗涤细胞，室温离心(500g)5分钟，去除上清，保留细胞沉淀； 

7)重复步骤6)； 

8)在细胞沉淀中加入目标蛋白质特异性抗体100μl，混匀后37℃条件下作用30min； 

9)加入洗液洗涤细胞，保留细胞沉淀，去除未结合的特异性抗体； 

10)重复步骤9)； 

11)加入100μl荧光标记第二抗体，混匀后37℃避光作用30分钟； 

12)加入洗液洗涤细胞，去除上清； 

13)重复步骤12)； 

14)将细胞沉淀重悬于检测缓冲液中，4℃保存直至利用流式细胞仪或其他方法检测分析； 

15)对于检测的样品，均需设定未加入目标蛋白质特异性抗体的对照样品； 

16)数据分析，与对照样品相比，荧光细胞数目和/或荧光强度增加为阳性结果，荧光细胞数目和/或荧光强度没有改变为阴性结果。 

其中，步骤8)-11)可替换为在细胞沉淀中加入荧光标记的目标蛋白质特异性抗体，混匀后37℃条件下作用30min。 

其中，步骤1)中外周血样品为哺乳动物外周血。 

其中，步骤1)中固定液为溶解于磷酸盐缓冲液(PH＝7.2)中的2％(w/v)多聚甲醛溶液，加入固定液体积为起始外周血样品体积的5倍。 

其中，步骤4)中破膜剂为溶解于磷酸盐缓冲液(PH＝7.2)中的0.04％(v/v)Triton-100溶液，加入破膜剂的体积为起始外周血样品体积的5倍。 

其中，步骤3)、6)、7)、9)、10)、12)、13)中洗液为磷酸盐缓冲液(PH＝7.2)、NaCl溶液、Tris-HCl缓冲液，加入洗液体积为起始外周血样品体积3-5倍，优选为3、4、5倍，更优选为5倍。 

其中，步骤8)中目标蛋白质为外周血有核细胞胞内(包括细胞浆和细胞核)表达的蛋白质，特异性抗体为能用于细胞免疫荧光标记的抗体。 

其中，步骤11)中第二抗体为可识别步骤8)中的特异性抗体的抗体。 

其中，步骤14)中检测缓冲液为溶解于磷酸盐缓冲液(PH＝7.2)中的1％(w/v)多聚甲醛溶液。 

利用本发明所述的一种检测外周血有核细胞胞内蛋白质的方法较现有技术具有明显的优越性： 

1)方法简单，在对有核细胞破膜同时，去除外周血中的红细胞，无需其他红细胞裂解步骤，方法快速、节省时间。 

2)在有核细胞固定后裂解红细胞，不会对有核细胞内产生影响，保证结果的真实性。 

3)该方法可结合于流式细胞仪、荧光显微镜等仪器分析，具有较好的推广性。 

附图说明：

图1：阴性对照样品流式细胞仪检测散点图。 

图2：阴性对照样品流式细胞仪检测荧光强度图。 

图3：检测样品流式细胞仪检测散点图。