[发明专利]一种检测外周血有核细胞胞内蛋白质的方法

权利要求书

1.一种检测外周血有核细胞胞内蛋白质的方法，其特征在于包括如下步骤：

1)在外周血样品中加入5倍体积固定液，室温作用30分钟；

2)室温离心(500g)5分钟，去上清；

3)加入洗液对细胞沉淀进行洗涤，室温条件下离心(500g)5分钟，去除上清，保留沉淀；

4)加入5倍外周血样品体积的破膜剂，混匀细胞沉淀，室温作用15min；

5)室温离心(500g)5分钟，去上清；

6)加入洗液洗涤细胞，室温离心(500g)5分钟，去除上清，保留细胞沉淀；

7)重复步骤6)；

8)在细胞沉淀中加入目标蛋白质特异性抗体，混匀后37℃条件下作用30min；

9)加入洗液洗涤细胞，保留细胞沉淀，去除未结合的特异性抗体；

10)重复步骤9)；

11)加入荧光标记第二抗体，混匀后37℃避光作用30分钟；

12)加入洗液洗涤细胞，去除上清；

13)重复步骤12)；

14)将细胞沉淀重悬于检测缓冲液中，4℃保存直至利用流式细胞仪或其他方法检测分析；

15)对于检测的样品，均需设定未加入目标蛋白质特异性抗体的对照样品；

16)数据分析，与对照样品相比，荧光细胞数目和/或荧光强度增加为阳性结果，荧光细胞数目和/或荧光强度没有改变为阴性结果。

2.如权利要求1所述的方法，其特征是：所述步骤8)-11)替换为在细胞沉淀中加入荧光标记的目标蛋白质特异性抗体，混匀后37℃条件下作用30min，不需要设置对照样品。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征是：步骤1)中外周血样品为哺乳动物外周血。

4.如权利要求1或2所述的方法，其特征是：步骤1)中固定液为溶解于磷酸盐缓冲液(PH＝7.2)中的2％(w/v)多聚甲醛溶液，加入固定液体积为起始外周血样品体积的5倍。

5.如权利要求1或2所述的方法，其特征是：步骤4)中破膜剂为溶解于磷酸盐缓冲液(PH＝7.2)中的0.04％(v/v)Triton-100溶液，加入破膜剂的体积为起始外周血样品体积的5倍。

6.如权利要求1或2所述的方法，其特征是：步骤3)、6)、7)、9)、10)、12)、13)中洗液为磷酸盐缓冲液(PH＝7.2)的缓冲液，加入洗液体积为起始外周血样品体积3-5倍。

7.如权利要求1或2所述的方法，其特征是：步骤8)中目标蛋白质为外周血有核细胞胞内(包括细胞浆和细胞核)表达的蛋白质，特异性抗体为能用于细胞免疫荧光标记的抗体。

8.如权利要求1或2所述的方法，其特征是：步骤11)中第二抗体为可识别步骤8)中的特异性抗体的抗体。

9.如权利要求1或2所述的方法其特征是：步骤14)中检测缓冲液为溶解于磷酸盐缓冲液(PH＝7.2)中的1％(w/v)多聚甲醛溶液。