[发明专利]一种电离辐射致外周血淋巴细胞DNA损伤的评价方法

说明书

技术领域

本发明涉及细胞的检测方法，具体涉及一种电离辐射致外周血淋巴细胞DNA损伤的评价方法。

技术背景

外周血淋巴细胞是电离辐射的敏感细胞，是研究电离辐射致DNA损伤的细胞模型之一。γ-H2AX蛋白质是DNA损伤后发生改变的分子，是DNA损伤的特异性分子。对γ-H2AX蛋白质的检测可以评价DNA损伤情况，对于研究DNA损伤的分子机制有广泛地应用。流式细胞仪具有快速、高通量等特点，可以检测细胞内γ-H2AX蛋白质的含量。目前利用流式细胞仪分析外周血淋巴细胞中γ-H2AX蛋白质的含量的方法存在实验重复性差，不同个体来源外周血样品之间差异大等问题，这些问题是因为缺少对照细胞，增加实验误差所引起的。

发明内容

本发明的目的是解决流式细胞仪分析外周血淋巴细胞中γ-H2AX蛋白质含量的方法存在实验重复性差，不同个体之间差异大等问题。我们的研究发现电离辐射后外周血淋巴细胞中γ-H2AX蛋白质含量增加，而粒细胞中γ-H2AX蛋白质含量不受电离辐射影响，可以作为分析淋巴细胞中γ-H2AX蛋白质含量的对照细胞，采用γ-H2AX的RL/G值(淋巴细胞的γ-H2AX蛋白质含量与粒细胞中γ-H2AX蛋白质含量的比值)来评价电离辐射后外周血淋巴细胞DNA损伤程度。本发明提供一种电离辐射致外周血淋巴细胞DNA损伤的评价方法。该方法操作简单，结果稳定，可以广泛应用于诊断、细胞生物学研究等领域。

本发明的一种电离辐射致外周血淋巴细胞DNA损伤的评价方法包括下列步骤：

1)外周血样品有核细胞的固定；

2)洗涤细胞，去除固定液；

3)加入破膜剂对有核细胞破膜，裂解红细胞；

4)洗涤细胞，去除破膜剂；

5)加入荧光标记的抗γ-H2AX蛋白质的特异性抗体；

6)洗涤细胞，去除未结合的抗体；

7)流式细胞仪检测样品中淋巴细胞对应的荧光强度值，即为γ-H2AX蛋白质的含量；

8)流式细胞仪检测样品中粒细胞对应的荧光强度值，即为γ-H2AX蛋白质的含量；

9)计算步骤7)中淋巴细胞的γ-H2AX蛋白质含量与步骤8)中粒细胞中γ-H2AX蛋白质含量的比值——γ-H2AX的RL/G值；

10)DNA损伤程度的判断方法

γ-H2AX的RL/G值＜1.5为正常；γ-H2AX的RL/G值＞1.5为DNA损伤，γ-H2AX的RL/G值越大，DNA损伤越严重。

附图说明

图1：不同剂量γ射线照射后外周血淋巴细胞和粒细胞中γ-H2AX蛋白含量变化。

图2：62名未受照射人外周血γ-H2AX的RL/G值，平均值为1.21±0.12(1.01～1.54)。

图3：不同剂量γ射线照射后外周血γ-H2AX的RL/G值的变化。

具体实施方式

实施例

1)利用肝素抗凝管取健康人外周血0.9ml，平均分为3份，每份0.3ml，其中第1份未照射，第2份经2Gyγ射线照射，第3份经6Gyγ射线照射；

2)血样加入1.5ml固定液(2％多聚甲醛溶液)，室温作用30分钟；

3)室温离心(500g)5分钟，去上清；

4)利用1.5ml PBS缓冲液对细胞沉淀进行洗涤，室温条件下离心(500g)5分钟，去除上清，保留沉淀；

5)加入1.5ml浓度为0.4％的Triton-100溶液，混匀细胞沉淀，室温作用15min；

6)室温条件下离心(500g)5分钟，去上清；

7)加入1.5ml PBS缓冲液洗涤细胞，室温离心(500g)5分钟，去除上清，保留细胞沉淀；

8)重复步骤6)；

9)在细胞沉淀中加入小鼠抗人γ-H2AX抗体100μl(1∶200倍稀释)，混匀后37℃条件下作用30min；

10)1.5mlPBS洗涤细胞，保留细胞沉淀，去除未结合的抗体；

11)重复步骤9)；

12)加入100μl FITC标记的兔抗小鼠IgG(第二抗体，1∶200倍稀释)，混匀后37℃避光作用30分钟；

13)1.5mlPBS缓冲液洗涤细胞，弃上清；

14)重复步骤12)；

15)流式细胞仪检测样品中淋巴细胞对应的荧光强度值，即为淋巴细胞的γ-H2AX蛋白质的含量；

16)流式细胞仪检测样品中粒细胞对应的荧光强度值，即为粒细胞的γ-H2AX蛋白质的含量；