[发明专利]耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)疫苗重组蛋白抗原FnbA1的纯化方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术制药领域，涉及一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)疫苗重组蛋白抗原FnbA1的纯化方法。 

背景技术

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcusaureus，MRSA)局部感染经久不愈，全身感染死亡率高达20％。自1961年被首次发现，目前已成为全球ICU病房、烧伤、战创伤等感染率最高的病原菌之一。MRSA因其传播途径广泛，易暴发流行，又由于其致病性强，呈多重耐药而成为临床上治疗的难点及重要的生物战剂，被称为“超级细菌”，当前MRSA已与乙型肝炎、AIDS被列为世界三大最难解决的感染性疾病，并位居首位。万古霉素被认为是治疗MRSA的最后一道防线，但2002年以来耐万古霉素的MRSA相继被分离出来，使MRSA即将面临无抗生素可治的严峻挑战。 

目前，在我国各大医院，由于抗生素的滥用，MRSA的分离检出率逐年上升，已由1978年的5％发展到2009年的79％，且菌群的毒力基因改变明显，并且耐万古霉素的金葡菌也呈蔓延趋势。基于这种严峻形势，我国已将MRSA列为21世纪可能对国人卫生健康有重大影响的12种病原微生物之一。2010年“中国MRSA院内感染诊治策略新进展”会议资料显示，我国内地医院院内感染发生率约为8％，全国每年因医院感染造成的直接损失超过150亿元。因此，加强对MRSA感染的防治研究已迫在眉睫，研制安全、有效的新型MRSA疫苗将对有效控制MRSA耐药性蔓 延和临床MRSA广泛感染具有重大应用价值。美国研发的MRSA疫苗已进入III期临床试验，研发具有自主知识产权、高效、安全、经济的MRSA疫苗对有效控制MRSA耐药性蔓延和临床MRSA广泛感染，提升我国的国际竞争力具有重要意义。 

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌抗原组分复杂，且含量较低，直接从全菌中分离纯化出保护性抗原的难度较大，方法繁琐，不利于疫苗的产业化制备。利用基因工程技术将菌体有效的保护性抗原进行克隆表达使MRSA疫苗研制的可行性大大提高。金黄色葡萄球菌表面的粘附素是一类能够介导细菌粘附于寄主细胞表面进而引发疾病的膜蛋白，其中纤连蛋白结合蛋白A(FnbA)是重要的粘附素之一，编码基因具有高度保守性，是MRSA疫苗重要的候选抗原。它能够介导金黄色葡萄球菌结合于细胞表面的纤连蛋白，使细菌黏附于寄主细胞表面，促进细菌对寄主组织的入侵，目前分离到的大多数金黄色葡萄球菌都能够与细胞外基质上的纤连蛋白特异性的结合。 

申请人采用生物信息学的方法从FnbA中预测出了一段活性片段FnbA1，通过克隆表达并纯化后，动物试验证明可有效刺激机体产生较高的体液免疫应答和良好的免疫保护作用。FnbA1具有序列表1所述的核苷酸序列和序列表2所述的氨基酸序列。 

发明内容

本发明旨在针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌重组蛋白抗原(FnbA1)制备中的抗原蛋白纯化，，提供一种工艺简捷、所获得目标蛋白纯度高、回收率较好的纯化工艺和方法。 

为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案。 

一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌疫苗重组蛋白抗原的纯化方法，包含步骤： 

收集发酵的表达FnbA1的工程菌后，按照高压破菌、离心，硫酸铵分步沉淀，GST亲和层析、PP酶切，离子交换层析、凝胶过滤层析技术的顺序组合对制备的抗原进行纯化。 

步骤具体为： 

1)高压破菌：将收集的抗原的菌体以pH为7.0-7.5的10-20mM PBS缓冲液混匀悬浮，预冷后采用高压匀浆破菌，高速离心，收集上清； 

2)硫酸铵分步沉淀：4℃搅拌条件下，上清中缓慢加入终浓度为30％的硫酸铵，搅拌半小时以上，10000-15000g高速离心20分钟以上，收集上清，上清中继续缓慢加入终浓度为40％的硫酸铵，搅拌半小时以上，10000-15000g高速离心20分钟以上，收集沉淀； 

3)沉淀复溶：称量沉淀湿重，按重量体积比为1∶10比例加入pH为7.0-7.5的10-20mM的PBS缓冲液，搅拌混匀10-15分钟，10000-15000g高速离心20分钟以上，收集上清； 

4)GST亲和纯化：选择GST亲和层析填料进行初步纯化，使用PBSpH7.0-7.5的条件下对目标蛋白进行纯化，Prescission Protease酶进行酶切洗脱；