[发明专利]耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)疫苗重组蛋白抗原FnbA1的纯化方法

权利要求书

1.一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)疫苗重组蛋白抗原FnbA1的纯化方法，其特征在于，包含步骤：收集制备的所述抗原；按照高压破菌、离心，硫酸铵分步沉淀，GST亲和层析、PP酶酶切，离子交换层析、疏水层析和脱盐的顺序组合对制备的抗原进行纯化。

2.如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：

1)高压破菌：将收集的菌体以pH为7.0-7.5的10-20mM PBS缓冲液混匀悬浮，预冷后采用高压匀浆破菌，高速离心，收集上清；

2)硫酸铵分步沉淀：4℃搅拌条件下，上清中缓慢加入终浓度为30％的硫酸铵，搅拌半小时以上，10000-15000g高速离心20分钟以上，收集上清，上清中继续缓慢加入终浓度为40％的硫酸铵，搅拌半小时以上，10000-15000g高速离心20分钟以上，收集沉淀；

3)沉淀复溶：称量沉淀湿重，按重量体积比为1∶3-10比例加入pH为7.0-7.5的10-20mM的PBS缓冲液，搅拌混匀10-15分钟，10000-15000g高速离心20分钟以上，收集上清；

4)GST亲和纯化：选择GST亲和层析填料进行初步纯化，使用PBSpH7.0-7.5的条件对目标蛋白进行纯化，Prescission Protease酶进行酶切洗脱；

5)离子交换层析纯化：步骤4)收集的样品，pH调至9.0，使用pH为9.0，10～50Tris，0～0.1M NaCl的Tris缓冲液平衡层析系统及离子交换层析柱，然后采用pH为9.0，10～50Tris，0.5～1M NaCl的buffer梯度洗脱；

6)疏水层析纯化：将步骤5)纯化获得的样品，按1∶1的比例与pH为7.5的20mM PB，3M(NH₄)₂SO₄混合，采用缓冲液pH为7.5的10mMPB，1.5M(NH₄)₂SO₄平衡层析系统和疏水层析柱后上样，采用pH为7.5的10mM PB梯度洗脱，去除痕量非目标蛋白等杂质，分离纯化目标蛋白。

7)脱盐：采用PBS平衡脱盐柱，将步骤6)纯化获得的样品通过脱盐柱置换缓冲液。

3.如权利要求2所述的纯化方法，其特征在于，步骤1)采用生产或中试纯化中的60-80MPa高压匀浆破菌技术，高速离心获取破菌上清。

4.如权利要求2所述的纯化方法，其特征在于，步骤2)和步骤3)硫酸铵分步沉淀再复溶。

5.如权利要求2所述的纯化方法，其特征在于，步骤4)所述的GST亲和纯化所使用的填料为GST-Sepharose 4B、GST-Sepharose 6B、GST-Sepharose FastFlow、GST-Sepharose HP之一。

6.如权利要求5所述的纯化方法，其特征在于，步骤4)所使用的Prescission Protease酶带有GST标签，以利于去除Prescission Protease酶。

7.如权利要求2所述的纯化方法，其特征在于，步骤5)所使用的离子交换层析填料为Q HP、RESOURCE Q、Q FF、Adhere之一。

8.如权利要求2所述的纯化方法，其特征在于，步骤6)所述的疏水层析柱为phenyl或butyl。

9.如权利要求1至8任一项所述的纯化方法，其特征在于，所述抗原是通过以下步骤制备的：

1)设计正向引物和反向引物通过PCR扩增或全基因合成以获得编码FnBA1蛋白活性片段的核酸序列；

2)将步骤1)所获得的核酸序列克隆至表达载体构建重组载体，然后将该重组载体转化至宿主菌；

3)诱导转化后的宿主菌表达重组蛋白。