[发明专利]稳定共表达hST3GalIV和β1-4GalT1的MDCK细胞系及构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及工程细胞系MDCK-hST3GalIV-β4GalT1及其构建方法，所构建细胞系可用于禽流感疫苗株的大规模细胞化生产。

背景技术

流感病毒表面的血凝素(HA)通过与宿主细胞表面的唾液酸寡糖受体结合从而起始病毒感染宿主细胞，禽源和马源流感病毒偏嗜结合α2,3-唾液酸寡糖受体(Neu5Acα2,3Gal)，而人源和猪源流感病毒偏嗜结合α2,6-唾液酸寡糖受体(Neu5Acα2,6Gal)。因此，细胞表面唾液酸受体的类型及丰度，影响流感病毒对不同宿主的适应性。不同的唾液酸受体对流感病毒在宿主细胞中感染、复制和扩散产生重要的影响。

目前获得批准生产的是鸡胚来源的灭活疫苗。哺乳动物细胞生产的疫苗在动物模型中表现出较好的保护性作用，当前Madin-Darby犬肾上皮细胞系（MDCK）被认为是培养A型和B型流感病毒最适合的细胞系。

传统的流感病毒疫苗是依靠鸡胚生产的，病毒经过培养增殖、浓缩、灭活、进一步纯化，配制、无菌灌装，最后检测和放行。除了研发使用高产重组毒株作为A型流感的种毒，基本生产工艺在过去的60年几乎没什么变化。不仅成本代价高，而且鸡胚的残留物质还可能引起过敏反应，此外，当面临高致病流感病毒导致的全球大流行时，传统的鸡胚生产方法可能不足以满足全球疫苗市场的需求。因此，研究机构和疫苗公司正在合作开发新的生产技术，以达到省时高效的目的。为了获得流感疫苗生产的替代方法，疫苗公司已经尝试了许多新的途径。组织培养的细胞系作为鸡胚生产方式的一种补充或替代方法，已经引起了人们的重视。细胞生产系统主要具有以下优势：1)可以应用许多在鸡胚生产系统中得到临床验证的基本方法(如全病毒的生产、多步裂解、纯度更高的流感抗原或减毒活疫苗)，同时，缩短鸡胚生产的供应时间，稳定产品供应链；2)可以应用更加先进可控的种毒生产系统，由于生产用细胞特征的高度一致性，降低了引入外源性污染的风险；3)提供了一种更加高效、稳定、可重复的疫苗生产方式，使用一种规格可变且封闭的生物反应器，可以在任意时间起始反应，并可以根据需要延长生产周期；4)提高了部分禽流感毒株生产疫苗的能力。除了上述优点，以哺乳动物细胞生产疫苗至少具有一种理论上的优点：在鸡胚中进行的流感病毒的分离和复制通常会产生特定表型的选择，而这种选择往往不同于正确的人类分离株。相反，在细胞中进行的流感病毒的分离复制不会产生这种传代依赖性的表型选择。从而有利于表达天然构象的血凝素抗原，优化抗体的特异性。Madin-Darby犬肾上皮细胞系(MDCK)来源于一只成年猎犬的肾脏组织。关于MDCK细胞来源的季节性流感疫苗的临床试验结果表明，MDCK细胞来源的病毒经过连续传代之后，可以保持抗原的稳定性，此类疫苗的安全性和免疫原性与鸡胚来源的疫苗相当。

人源β-半乳糖苷α2,3-唾液酸转移酶IV(hST3GalIV)能将唾液酸(Neu5Ac)转移到糖蛋白的末端的2型糖链(Galβ1-4GlcNAc)，或者1型糖链(Galβ1-3GlcNAc)上的半乳糖(Gal)，Neu5Ac和末端的Gal之间连键是α2-3。hST3GalIV优先作用于2型糖链(Galβ1-4GlcNAc)，其次才是1型糖链(Galβ1-3GlcNAc)。

人源β1-4半乳糖基转移酶1(UDP-半乳糖：N-乙酰氨基葡萄糖基β1-4半乳糖基转移酶，简称为β1-4GalT1，EC2.4.1.38)，是一组Ⅱ型膜结合糖蛋白，能把半乳糖基(Gal)转移到糖链的N-乙酰葡萄糖(GlcNAc)上，Gal与GlcNAc之间的连键是β1-4。

发明内容

本研究首次建立了提高禽流感病毒α2,3-唾液酸丰度的MDCK细胞系--MDCK-hST3GalIV-β4GalT1细胞。通过稳定共表达hST3GalIV和β1-4GalT1，可以增强β1-4GalT1催化半乳糖与N-乙酰葡萄糖以β1-4连键连接的效力，hST3GalIV催化唾液酸与半乳糖以α2-3连键连接的效力，从而提高MDCK细胞表面α2,3-唾液酸丰度。该稳定表达细胞系细胞表面α2,3-唾液酸显著高于母本MDCK细胞系，与母本MDCK细胞系相比，禽流感病毒的分离株和疫苗候选株在MDCK-hST3GalIV-β4GalT1细胞系上形成更大的噬斑，生长滴度更高。