[发明专利]稳定共表达hST3GalIV和β1-4GalT1的MDCK细胞系及构建方法和应用

权利要求书

1.一种稳定表达hST3GalIV和β1-4GalT1的MDCK细胞系，是MDCK-hST3GalIV-β4GalT1，其含有hST3GalIV和β1-4GalT1基因序列；所述hST3GalIV的基因序列如SEQ ID No: 1所示，所述β1-4GalT1的基因序列如SEQ ID No: 3所示；所述细胞系的保藏号是CGMCC No. 5967。

2.权利要求1所述的稳定表达hST3GalIV和β1-4GalT1的MDCK细胞系的构建方法，其特征在于，是将带有编码hST3GalIV基因序列的真核表达质粒和带有编码β1-4GalT1基因序列的真核表达质粒转染至MDCK细胞，最终获得能稳定表达hST3GalIV和β1-4GalT1基因的细胞系MDCK-hST3GalIV-β4GalT1。

3.根据权利要求2所述MDCK-hST3GalIV-β4GalT1细胞系的构建方法，其特征在于包括以下具体步骤：

1）MDCK细胞的转染及抗性细胞克隆的筛选

转染： MDCK细胞密度在6孔板至80%～90%密度时用于转染；将编码hST3GalIV基因序列的真核表达质粒和编码β1-4GalT1基因序列的真核表达质粒各1μg质粒于100 μL无血清Opti-MEM培养基中，混匀后添加5 μL FuGENE^?HD转染试剂，充分混匀之后室温孵育15分；将上述复合物覆盖于细胞表面，补加无血清Opti-MEM培养基至总体积为2 mL，置于37℃、5% CO₂培养箱中培养24小时后移除培养物，更换为新鲜的含10%胎牛血清的DMEM培养基继续培养；

抗性细胞克隆的筛选： 转染后36小时后用胰酶消化细胞，按1:10 的比例传代至48孔细胞板中，继续用含0.8 mg/mL G418的10%胎牛血清DMEM培养基为筛选培养基培养，每孔200 μL，每3天换一次筛选培养基，G418持续筛选10-14天后，可见有抗性细胞生长；选择生长状态良好的抗性细胞集落，继续用于单克隆细胞筛选：用含0.8 mg/mL G418的筛选培养基将细胞密度稀释至1个/100 μL，铺于96孔细胞板中50 μL，每孔补加50 μL筛选培养基；持续筛选10天后选择表达水平最高的克隆再次按有限稀释法进行单克隆筛选，以确保筛选出单克隆抗性细胞；选出的细胞依次于96孔、24孔和 6孔细胞培养板中扩大培养并冻存于液氮中；

2）MDCK-hST3GalIV-β4GalT1细胞系的鉴定

提取上述所获具有抗性细胞的RNA，并反转录形成cDNA，以反转录成的cDNA为模板，用PCR方法分别通过PCR反应扩增人源β-半乳糖苷α2,3-唾液酸转移酶IV基因和β1-4半乳糖转移酶1基因；扩增结果表明MDCK-hST3GalIV-β4GalT1细胞系已成功构建，

用于扩增人源β-半乳糖苷α2,3-唾液酸转移酶IV(hST3GalIV)的引物：

3G4F：5’- ATGGTCAGCAAGTCCCGCTGGAAG-3’

3G4R：5’-TCAGAAGGACGTGAGGTTCTTG-3’

用于扩增人源β1-4半乳糖转移酶1(β1-4GalT1)的引物：

B4G1F：5’- ATGAGGCTTCGGGAGCCGCTCCTGAG-3’

B4G1R：5’- CTAGCTCGGTGTCCCGATGTCCAC-3’。

4.权利要求1所述MDCK-hST3GalIV-β1-4GalT1细胞系用于提高禽流感病毒分离株的生长滴度以及噬斑形成能力。

5.权利要求1所述MDCK-hST3GalIV-β1-4GalT1细胞系在生产疫苗中的应用。