[发明专利]一种蚓激酶干粉的制备方法

权利要求书

1.一种蚓激酶干粉的制备方法，包括如下步骤：

1)蚯蚓清洗和解冻：将鲜蚯蚓用水清洗后，洗去污泥和粘性物，然后贮存在冷库中备用；将冻蚓室温放置自然化冻；

2)制浆：加入蚯蚓体积的0.5～2倍的水，将经步骤1)化冻后的蚯蚓粉碎，制成匀浆；

3)生物酶处理：将步骤2)得到的匀浆在30～40℃，优选35～40℃保温，同时加入中性蛋白酶，按蚯蚓重量的0.1%～0.3%加入匀浆液中，保温静置2～6小时，优选保温静置2～4小时；

4)离心：将步骤3)的匀浆液定量的加水稀释，最终定容体积至2～3.5倍，通过蝶片式离心机除去其中的粗渣；

5)澄清：经步骤4)除渣后的的离心液，输入到膜过滤系统内，加水洗涤，得到一次澄清液；

6)超滤：步骤5)得到的澄清液采用中空纤维柱超滤，得到超滤液；

7)澄清：经步骤6)超滤后的溶液经泵再次打入膜过滤系统，加水洗涤，得到二次澄清液；

8)调节PH：配制0.5～1M的氢氧化钠溶液，调整步骤7)得到的澄清液至pH6.5～8.5，用PH计监测；

9)层析分离：采用阴离子交换层析柱分离步骤8)调整PH值后的澄清液，用0.3～0.9M的磷酸盐溶液梯度洗脱，洗脱液颜色变成酒红色时开始收集，洗脱至料液变清澈，颜色呈柠檬黄色或桔黄色为止；

10)超滤浓缩：将步骤9)得到的洗脱液经中空纤维柱或自动化层析超滤系统超滤，除盐脱水，且溶液电导率≦0.2×10³μs/cm合格；

11)澄清过滤：采用纸浆板板框过滤装置，滤除步骤10)得到的浓缩液中的悬浮物质，得到澄清液；

12)冻干：在洁净区将步骤11)的澄清液于－30～－40℃下冷冻10小时,继续升温至40～45℃干燥得到蚓激酶干粉。

2.前述任一项权利要求所述的蚓激酶干粉的制备方法，其特征在于，步骤3)中的所述生物酶为选自菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、沙雷肽酶和端肽酶中的一种或者多种。

3.前述任一项权利要求所述的蚓激酶干粉的制备方法，其特征在于，步骤3)中的所述生物酶为选自沙雷肽酶和端肽酶中的一种或者多种。

4.前述任一项权利要求所述的蚓激酶干粉的制备方法，其特征在于，所述步骤3)于35～40℃保温静置2～6小时。

5.前述任一项权利要求所述的蚓激酶干粉的制备方法，其特征在于，所述步骤3)于35～40℃保温静置2～4小时。

6.前述任一项权利要求所述的蚓激酶干粉的制备方法，其特征在于，所述步骤5)中的膜过滤系统操作条件为：操作压力为0.12MPa、洗脱液流速小于1.6M³/hr。

7.前述任一项权利要求所述的蚓激酶干粉的制备方法，其特征在于，所述步骤6)超滤是采用标准截流分子量为5K～10K的立式膜中空纤维柱进行的。

8.前述任一项权利要求所述的蚓激酶干粉的制备方法，其特征在于，所述步骤6)超滤是采用标准截流分子量为8K的立式膜中空纤维柱进行的。

9.前述任一项权利要求所述的蚓激酶干粉的制备方法，其特征在于，所述步骤8)调节澄清液至pH7.0～8.5。