[发明专利]一种RNA的预备模板PCR检测方法

说明书

（一）技术领域

本发明涉及一种RNA的预备模板PCR（Template-Ready PCR，TRPCR）检测方法。

（二）背景技术

RNA是遗传信息传递的载体。RT-PCR （reverse transcription逆转录-聚合酶链反应），指将逆转录反应 （Reverse Transcription，RT）和PCR （Polymerase Chain Reaction） 反应组合在一起的方法. RT- PCR将以RNA为模板的cDNA合成，即RT，同PCR结合在一起，提供了一种分析基因表达的快速灵敏的方法。RNA的RT-PCR检测或定量分析，比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及 S1核酸酶分析在内的RNA分析技术，更灵敏，更易于操作，已发展成为进行基因表达水平的检测分析，病原体的检测分析等有力的手段。

RT-PCR的模板可以为总RNA或poly（A）+RNA. 其中RT需要用逆转录酶，可以用随机引物、oligo（dT）或基因特异性的引物（GSP）起始.  RT和PCR可以在两个反应管中分步先后进行 （两管法），也可以在一个反应管中先后进行（一管法）。两管法比较常见，在两管法RT-PCR中，每一步都可以尽量在最佳条件下进行，但由于RT体系中含有PCR抑制物，所以一般只能取出约5%的RT产物进行PCR，这限制了最终检测的灵敏度，但在使用一个样品检测多个目标RNA时比较很有用——因为一个RT产物可以分别用于很多个PCR反应。一管法RT-PCR中，RT和PCR在一只管中进行，必须尽可能地提供同时为逆转录和PCR优化的条件. 一步法RT-PCR在处理大量样品时易于操作，有助于减少残余污染，因为在cDNA合成和扩增之间不需要打开管盖. 一步法优化成功的话，可以得到更高的灵敏度，最低可以达到0.1pg总RNA，这是因为整个cDNA样品都被扩增 – 理论上灵敏度可以比两管法提高20倍. 然而，为一步法RT-PCR优化的条件很难掌控，经常会带来严重的非特异扩增，而且成本上有很大提升.

虽然RT-PCR在科研领域的推广普及程度很高，但在临床检测应用方面，仍存在很大的改进空间. 主要问题包括: 步骤繁琐，对操作要求高，特别是2种酶促反应 （RT和PCR） 的最优反应条件是有差异的，容易受到各种抑制物质的影响，也容易受到非特异扩增和假阳性的困扰，最后，逆转录酶的价格居高不下，操作成本很难降下来.

（三）发明内容

本发明目的是提供一种操作简单快速、特异性强的用于RNA检测的预备模板PC检测方法。

本发明采用的技术方案是：

一种RNA的预备模板PCR检测方法，所述方法包括：

（1）设计与目标RNA上任意一段序列互补的长度为25~40mer的单链寡核苷酸DNA，记为探针A；探针A的GC含量为40-60%，解链温度（Tm值）为70-85^oC；将探针A锚定在PCR管内，得到锚定PCR管；探针A的锚定可以采用本领域常规方法进行，用于锚定探针A的固体介质，可以是塑料离心管，也可以是磁珠，凝胶颗粒或其他可以吸附结合核酸的固体介质；

（2）设计部分序列与目标RNA上任意的另一段序列互补的单链寡核苷酸DNA，其结构为: 两端是特异的长度为20~30mer的PCR引物序列、中间为与目标RNA互补的长度为25~40merbp的序列，记为探针B；探针B 的GC含量为40-60%，解链温度（Tm值）为70-85^oC，与探针A和目标RNA的结合区域互不重叠。

（3）取待测样本，加入探针B和裂解液，反复吸打，转移至离心管中，冰上放置20min，4℃离心，取上清液，得到裂解上清液；所述裂解液为本领域常规含有表面活性剂（如吐温20、NP-40等）、用于细胞或组织裂解的缓冲液；

待测样本可来自组织或细胞，或者临床标本如痰液、血液等；

待测样本来自痰液时，裂解上清液获得方法如下：1~5 ml痰液 + 5~10 ml 痰融液，37℃振荡 10min，4℃、5000 rpm 离心10min，弃上清，取沉淀+ 200 ul裂解液（其中探针B浓度为1nmol/L），反复吸打，转移到1.5 ml 离心管中，冰上放置20min，4℃、15000 rpm 离心20min，取上清，得到裂解上清液；痰融液组成: PBS+0.1%（w/vol）DTT。