[发明专利]固相-数字PCR芯片及其制作方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物芯片研究领域，特别涉及一种固相-数字PCR芯片及其制作方法。

背景技术

在进行生物研究和实际检测时，有时待测DNA样品的量较少或者从样品中提取的待测DNA分子浓度较低时，为了得到较好的结果，通常需要先对样品分子的量进行聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)。虽然常规的PCR技术已广泛应用于生命科学研究及相关领域，并且在应用过程中不断得到改进，但目前仍然存在着耗时太长，操作繁琐，试剂消耗量大，扩增结果不稳定等缺点。因此人们一直在寻求更快速更简便的PCR方法。

固相PCR是将特定的引物寡核苷酸通过不同的方法固定在固相支持物上来扩增目的DNA。固相支持物有琼脂糖小珠，聚丙烯酰胺小珠，乳胶小珠，磁珠，普通玻片以及硅片等。固相PCR可以将核酸扩增、核酸分离和核酸检测三个相互独立的步骤整合在一起，避免常规PCR扩增的一些干扰因素，PCR反应产物易于分离纯化，同时可实现多个不同扩增反应的同步进行。固相PCR在快速基因分型、药学基因组学以及基于基因组学的药物发展中有广泛的用途。

数字PCR是最新的DNA定量技术，其基于单分子PCR并采用计数的方法对DNA进行定量，因此是一种绝对定量的工具。将大量的稀释后的DNA溶液分散至芯片的微量反应体系中，每个反应体系的DNA模板数少于1个。在PCR循环反应之后，可根据发出荧光信号的微量反应体系所占有的比例来判定原始DNA浓度。

固相-数字PCR两者的结合，利用了数字PCR的特点实现了在微量体系中低浓度待测DNA的定量检测，同时亦可通过固相PCR将待测DNA片段多重拷贝固定在盖片表面，可用于后续全基因组测序、单核苷酸多态性(SNP)分析、多重基因表达分析。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种固相-数字PCR芯片及其制作方法，其制作简单，易操作，成本低廉。并且综合了固相PCR高通量、低干扰的优势同时兼具数字PCR低浓度定量检测的特点，为低浓度、稀有样品DNA定量检测及其后续全基因组测序、单核苷酸多态性(SNP)分析、多重基因表达分析等提供良好的操作平台。

本发明提供一种固相-数字PCR芯片的制作方法，包括如下步骤：

步骤1：取一基片，去除表面有机及无机杂质，并进行真空干燥；

步骤2：在基片正面生长牺牲层；

步骤3：通过光刻工艺和刻蚀工艺将掩模图形转移到牺牲层上；

步骤4：以牺牲层为掩膜，通过刻蚀工艺，在基片上形成微孔阵列；

步骤5：取一盖片，去除表面有机及无机杂质，并进行真空干燥；

步骤6：在盖片正面旋涂PDMS膜，并加热使PDMS膜固化；

步骤7：对PDMS膜进行表面处理，并将DNA探针结合在PDMS膜的表面；

步骤8：将基片与盖片键合，使基片上微孔阵列中的每个微孔形成独立反应池，形成固相-数字PCR芯片。

本发明还提供一种固相-数字PCR芯片，包括：

一基片；

一微孔阵列，该微孔阵列通过光刻工艺和两步刻蚀工艺制作在基片上；

一盖片；

一PDMS膜，该PDMS膜通过旋涂、加热固化在盖片表面；

该基片，微孔阵列，盖片与PDMS膜形成了固相-数字PCR芯片。

附图说明

为了进一步说明本发明的内容和特点，以下结合附图及实施例对本发明做一详细描述，其中：

图1为本发明流程图；

图2为固相-数字PCR芯片制作的步骤示意图。

具体实施方式

请参阅图1结合参阅图2所示，本发明为一种固相-数字PCR芯片的制作方法，包括如下步骤：

步骤1：取一基片10，去除表面有机及无机杂质，并进行真空干燥，所述基片10材料为硅片、石英片、光纤面板或有机薄片，清洗是依次使用超声波在分析纯三氯乙烯、丙酮、无水乙醇、去离子水中清洗，去除基片10表面的有机杂质，随后使用氨水和双氧水的混合液，盐酸和双氧水的混合液，硫酸和双氧水的混合液加热煮沸基片10，并使用去离子水冲洗，去除基片10表面的无机杂质，此种清洗方式可除去基片10表面的有机附着物和无机颗粒物，将清洗后的基片10用氮气吹干后装入培养皿中，之后放入真空干燥箱内前烘，前烘的温度一般高于100摄氏度，前烘操作目的是去除基片10本身附带的水蒸气；

步骤2：在基片10正面生长牺牲层，所述牺牲层材料和生长厚度依据后续刻蚀工艺以及刻蚀的深度而定；