[发明专利]特异性识别B-Raf突变蛋白的单克隆抗体、制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物科学和诊断试剂领域，特别涉及特异性识别B-Raf突变蛋白的单克隆抗体、制备方法及其作为诊断和治疗试剂的应用。 

背景技术

B-Raf蛋白(也称为v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1)是Raf/Mil丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族的成员之一。该蛋白在调控细胞增殖的Ras/Raf/MEK/ERK/MAP级联信号通路中期重要作用。B-Raf蛋白的突变在多种人类癌症，例如黑色素癌、甲状腺乳头状癌、直肠癌、卵巢癌中都存在（Garnett and Marais,Cancer Cell，6:313-319(2004)）。这些突变导致B-Raf蛋白的持续激活，进而促进细胞的增殖转化和癌细胞生长。V600E突变蛋白（第600位的缬氨酸（Valine，V）突变为谷氨酸（Glutamic Acid，E）的突变蛋白）在黑色素癌和甲状腺乳头状癌中存在十分普遍（Capper et al.,Acta Neuropathol，122(1):11-19(2011)）。其他的B-Raf突变包括N581S和V600K等。 

针对V600E突变蛋白的抑制剂正在研发中（Chapman et al.,N Eng J Med,364(26):2507-2516(2011)）。在这种抑制剂的使用过程中，需要一种能够特异性结合突变的B-Raf蛋白但是不结合野生型B-Raf蛋白的抗体。这种抗体可以被用来快速检测少量的取自病人的样品，用于诊断癌症。能够特异性结合B-Raf突变蛋白的抗体也是治疗癌症所迫切需要的。 

发明简介 

本发明的目的是为解决上述问题而提供了分别特异性地识别B-Raf N581S，B-Raf V600E和B-Raf V600K突变体蛋白的三种单克隆抗体、制 备方法及其应用。利用本发明的方法制备出的单克隆抗体能够分别特异性地识别B-Raf N581S，B-Raf V600E和B-Raf V600K突变体蛋白，而不识别野生型B-Raf蛋白。 

在一些操作实例中，所述的特异性识别B-Raf突变蛋白的单克隆抗体或者抗原结合部位，其特征在于，由一条重链和一条轻链组成；重链和轻链的CDR1、CDR2以及CDR3的氨基酸序列分别是由中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏号为CCTCC C201283/CCTCC C201284/CCTCC C201285、CCTCC C2012122以及CCTCC C2012112的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的CDR1、CDR2以及CDR3的氨基酸序列决定。在进一步的操作实例中，所述的特异性识别B-Raf突变蛋白的单克隆抗体或者抗原结合部位，其特征在于，由分别包含所述杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体的重链和轻链的可变区域的氨基酸序列的一条重链和一条轻链组成。在更进一步的操作实例中，抗体或者抗原结合部位包含上述杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体的重链和轻链可变区的氨基酸序列。 

本发明的单克隆抗体可以是一种人源化的或者嵌合型的抗体。在某些操作实例中，这种单克隆抗体是IgG。 

在一方面，本发明包括保存在中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏号为CCTCC C201283/CCTCC C201284/CCTCC C201285、CCTCC C2012122以及CCTCC C2012112的杂交瘤细胞。CCTCC C201283的分类命名为：杂交瘤细胞株M43#-1，保藏日期为：2012年6月18日；CCTCC C201284的分类命名为：杂交瘤细胞株M43#-2，保藏日期为：2012年6月18日；CCTCC C201285的分类命名为：杂交瘤细胞株M43-3，保藏日期为：2012年6月18日；CCTCC C201283的分类命名为：杂交瘤细胞株M43#-1，保藏日期为：2012年6月18日；CCTCC C2012122的分类命名为：杂交瘤细胞株M60-28，保藏日期为：2012年8月24日；CCTCC C2012112的分类命名为：杂交瘤细胞株M73-48，保藏日期为：2012年8月24日. 

本发明包括一种含有所述单克隆抗体或者抗原结合部位的药物或者可用于药物的载体。本发明还包括一种含有本发明中提到的单克隆抗体或者其抗原结合部位诊断试剂盒。