[发明专利]用于联合检测三种发热伴出疹病毒的液相芯片非诊断性方法及其制备方法

权利要求书

1.一种用于联合检测三种发热伴出疹病毒的液相芯片非诊断性方法，其特征在于，该非诊断性方法包括：

1）用带有生物素标记的引物进行发热伴出疹病毒多重PCR扩增；

2）偶联有捕获探针的编码微球在一定的条件下，捕获探针特异的与带有生物素标记的PCR产物结合；

3）加入链霉亲和素-藻红蛋白与微球上捕获的PCR产物上的生物素结合，利用悬浮芯片Luminex系统进行检测，通过激发微球基质上的红色分类荧光和微球表面经特异性反应结合上的藻红蛋白，对待检测物进行定性和定量分析。

2.如权利要求1所述的非诊断性方法，其特征在于，所述发热伴出疹病毒包括肠道病毒71、柯萨奇病毒A组16和麻疹病毒。

3.如权利要求2所述的非诊断性方法，其特征在于，所述肠道病毒71、柯萨奇病毒A组16和麻疹病毒的引物序列为：

。

4.如权利要求3所述的非诊断性方法，其特征在于，所述引物序列中Reverse 5’端加Biotin标记。 

5.如权利要求1所述的非诊断性方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为：cDNA模板2ul，PCR预混液15ul，各病毒上下游引物（10umol/L）1ul，去离子水补足30ul。反应条件：50℃30min；94℃2min；94℃30s，55℃30s，72℃45s，30个循环；72℃10min。

6.一种用于联合检测三种发热伴出疹病毒的液相芯片非诊断性方法其液相芯片的制备方法，该方法包括：

1）根据待检测的PCR产物，选择设计位于扩增区域内的特异的捕获探针；

2）捕获探针和互补探针合成；

3）相应的捕获探针偶联编码微球；

4）捕获探针偶联微球的验证。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述EV 71、CA16和MV的捕获探针及其互补序列序列为:

。

8.如权利要求7所述的，其特征在于，所述序列中每个probe 5’端加12个C或20个T再加-NH2修饰；RC-probe 5’端加Biotin标记。

9.如权利要求6所述的液相芯片制备方法，其特征在于，所述步骤2）中探针与微球偶联时的方法，包括以下步骤：

a)分别选取不同编号的编码微球，用漩涡振荡器振荡微球悬液，使微球 混合均匀；

b)分别取上述微球大约1.25ⅹ10⁶个，分别转移至离心管，14000g离心3～5min，小心吸出上清；

c)加入50μL0.1mol/L的2-(n-吗啉代)乙磺酸溶液，振荡20～30S,超声20～30s，使微球重悬；

d)用蒸馏水将合成的寡核苷酸探针稀释到0.1mmol/L；

e)将1～5μL稀释的探针加于微球悬浮液中，振荡混匀；

f)加入2.5μL新鲜配制的10mg/mL的EDC溶液至微球与探针混和液中，振荡混匀；

g)用铝箔包裹离心管避光，漩涡振荡器上400～600rpm振荡，室温孵育30min；

h)再次加入新鲜配制的10mg/mL EDC；

i)再次在漩涡振荡器上400～600rpm振荡，室温避光孵育30min；

j)用0.02%PBST 1ml洗涤1次，离心14000g 3～5min；

k)移弃上清，微球重悬于1ml 0.1%SDS中，洗涤，离心；

l)移弃上清，微球重悬于100μL pH8.0TE中，振荡悬起混匀，即得到偶联好的检测微球。

10.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤4）中偶联微球的验证方法，包括以下步骤：

1)取已经偶联好的检测探针每种各3500个于杂交液中，使其总量为33μL，根据微球计数结果计算相应加入量；

2)向各管中加5～17μL带有生物素标记的互补探针链，使其终体积为50μL，吹打混匀；

3)92℃~95℃变性10min；

4)杂交温度下杂交一定时间；

5)转移至滤板抽滤去掉未结合的互补探针链；

6)再向各孔加75μL 4ng/μLSA-PE的1×TMAC液，室温避光孵育10min，抽滤去掉未结合的SA-PE；

7)再向各孔加入75μL1×TMAC溶液，振荡使微球重悬；

8)反应结束后，Luminex system进行检测，通过激发微球基质上的红色分类荧光，对微球的编号进行识别；通过激发微球表面的藻红蛋白，读取荧 光强度MFI数值并分析数据；

9)结果判定：空白对照MFI低于100，包被微球MFI大于2000的可使用；若包被微球MFI小于2000，则说明包被不成功。