[发明专利]一种溶珊瑚弧菌多重毒力因子GeXP快速检测试剂盒和检测方法

说明书

技术领域：

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种专用于可导致珊瑚发生白化现象的病原弧菌—溶珊瑚弧菌（Vibrio coralliilyticus）的快速检测试剂盒和检测方法。

背景技术：

溶珊瑚弧菌(Vibrio coralliilyticus)是一种嗜盐性革兰阴性菌，属于弧菌科弧菌属，不能产生孢子的杆状细菌，因具有单根鞭毛而具有运动性，在海洋琼脂上菌落呈现奶油色，在TCBS培养基上显黄色，菌落边缘整齐光滑，最适生长温度为30摄氏度，最早从印度洋的白化珊瑚Pocillopora damicornis被分离到，后来在太平洋和红海地区的白化珊瑚中也陆续被分离到，同时在北大西洋牡蛎的幼体中也有发现。

近30年来，频繁爆发的各种珊瑚疾病是造成珊瑚退化的重要原因之一，其中白化病害因为具有强烈的传染性而对珊瑚的危害最为严重。在最初，研究者都认为珊瑚白化是由于外部环境变化引起，随着研究的不断深入，最后发现白化作为一种病害，是病原弧菌感染导致。其中溶珊瑚弧菌（Vibrio coralliilyticus）便是典型可以导致珊瑚发生白化现象的病原细菌。当水温高于26摄氏度时，该弧菌可以表达毒力因子感染珊瑚宿主、抑制与珊瑚共生的虫黄藻的光合作用，而使珊瑚发生白化现象。

目前检测病原微生物的方法很多，既有传统的分离鉴定的方法，也有免疫学的方法，但采用最多的还是分子生物学的方法，其主要依赖于PCR技术对某些特异性的基因进行扩增。可是这些方法都存在一定的缺陷：（1）检测耗时，过程繁琐；（2）检测灵敏度低，检测出病原菌时往往是发病晚期；（3）检测的目标基因过于单一，容易漏检，由于环境差异导致的同种不同菌株，不能全面反应该种病原菌的潜在致病性。因此，在做病原细菌的检测时，只有同时检测尽可能多的特异基因，才能使检测结果更加具有可靠性，对病原细菌的鉴定更加准确。

发明内容：

本发明的第一个目的是提供一种更为快速准确地评价溶珊瑚弧菌（Vibrio coralliilyticus）致病性的溶珊瑚弧菌多重毒力因子GeXP快速检测试剂盒。

本发明的溶珊瑚弧菌（Vibrio coralliilyticus）多重毒力因子GeXP快速检测试剂盒，包括PCR反应试剂，多基因PCR引物和GeXP多重扩增反应试剂，其特征在于，所述的多基因PCR引物包括20对溶珊瑚弧菌多重毒力相关因子的PCR引物和一对通用引物，具体为：

含有荧光标记的通用引物对序列，可按常规技术将荧光标记加到下述通用引物序列上，所述的荧光标记优选为CY5荧光标记，位于通用引物对序列的5’端：

TY-F:5’-AGGTGACACTATAGAATA-3’

TY-B:5’-GTACGACTCACTATAGGGA-3’

为毒力相关基因flhA(GenBank:NZ_ACZN01000015)设计的引物，扩增的片段大小约为147bp：

flhA-F：AGGTGACACTATAGAATATCCATATCAGGGCGAATCTC

flhA-R：GTACGACTCACTATAGGGACTTATTCCTGCGGTCCACAT

为毒力相关基因TonB(GenBank:NZ_ACZN01000007)设计的引物，扩增的片段大小约为154bp：

TonB-F：AGGTGACACTATAGAATACTCCTCAATCACAGCGTTCA

TonB-R：GTACGACTCACTATAGGGAGGCTTGAGTGTCAGCAACAA

为毒力相关基因RpoE(GenBank:NZ_ACZN01000012)基因设计的引物，扩增的片段大小约为161bp：

RpoE-F：AGGTGACACTATAGAATATTGCAAAAGGGGTTGAATCT

RpoE-R：GTACGACTCACTATAGGGACGAGCTTGATGGCTTGAGTT

为毒力相关基因dnaJ(GenBank:HM215580.1)基因设计的引物，扩增的片段大小约为168bp：

dnaJ-F：AGGTGACACTATAGAATATCGGTGACATTTTTGGTGAC

dnaJ-R：GTACGACTCACTATAGGGAGCGAACCGCTTCTTCTAGTG

为毒力相关基因VgrG(GenBank:NZ_ACZN01000017)基因设计的引物，扩增的片段大小约为175bp：