[发明专利]定性检测细胞色素氧化酶CYP2C19基因分型的测序引物对及其试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及体外核酸检测领域，尤其涉及一种在临床样本中检测常用药物代谢的细胞色素氧化酶CYP2C19基因的两个位点的基因分型的测序引物对及其试剂盒，即CYP2C19*2（681G/A）与CYP2C19*3（636G/A）两个位点的基因分型。

背景技术

细胞色素P450（CytochromeP450，CYP450）是由一组结构和功能相关的超家族基因（Superfamily gene）编码的同工酶，在人类身体中，其主要存在于肝细胞微粒中。在CYP450超家族中，CYP2是最大的家族，有15个亚家族，它们代谢约20%目前临床使用的药物。其中CYP2C19（S-美芬妥英羟化酶）是CYP450的主要成分之一，CYP2C19基因cDNA全长1940，含有9个外显子，编码区为1473bp。其编码的蛋白S-美芬妥英羟化酶代谢一系列临床药物，如氯吡格雷、美芬妥英、奥美拉唑、普萘洛尔、地西泮、去甲地西泮、舍曲林等。

研究表明很多药物代谢表型的差异源于CYP2C19基因突变，中国人常见的两种单核苷酸突变为CYP2C19*2型和CYP2C19*3型，分别为CYP2C19基因的第5外显子G681A和第4外显子G636A的突变。其中CYP2C19*2型G681A点突变产生了一个异常的拼接位点，使外显子5＇端的前40bp核苷酸发生缺失，改变了随后mRNA的阅读框，从而使蛋白的合成过早终止，使其合成的S-美芬妥英羟化酶缺乏血红素结合位点，使其失去活性。CYP2C19*3型G636A点突变使编码色氨酸密码子变为终止子，也导致蛋白合成提前终止，使合成的酶缺乏血红素及底物结合区而失去活性。这些点突变引起了S-美芬妥英羟化酶的活性和下降，代谢底物的能力减弱，使血药浓度增高，从而引起与血药浓度相关的药品不良反应。

根据CYP2C19基因型改变而引起酶代谢活性的改变，可将人群根据对药物代谢能力分为三大类：药物强代谢型(EM，extensive metabolisers)CYP2C19野生型，CYP2C19杂合型代表的是中间代谢型（IM），弱代谢型(PM)为突变型纯合子。CYP2C19*2在中国人中发生率是30％，CYP2C19*3是5％，而这两种突变几乎涵盖了中国人所有的弱代谢型（PM）。

CYP2C19基因型与肿瘤发病危险性：

CYP2C19基因的遗传多态性与多种肿瘤癌症的发生有关。研究结果表明，CYP2C19可能参与食管癌、胃癌、肺癌、急性白血病鳞状细胞肺癌、肝癌等前致癌物的活化，即CYP2C19基因的突变将增加患食管癌、胃癌、肺癌、急性白血病鳞状细胞肺癌、肝癌的危险性。因此，对人群中CYP2C19基因进行分型检测，能为临床上对某些肿瘤的易感性预测以及早期癌变预警提供重要的理论依据，有助于肿瘤癌症的前期预防。

CYP2C19基因主要影响的几种药物代谢有：

氯吡格雷：氯吡格雷为噻吩并吡啶衍生物，是一类新型的抗血小板药物，氯吡格雷本身无治疗效应，它由细胞色素P450氧化生成活性代谢产物（一种硫醇衍生物）而发挥作用。CYP2C19的变异是目前发现的氯吡格雷疗效个体差异的主要原因。CYP2C19基因的突变降低了氯吡格雷抗血小板聚集的疗效，并呈现出基因剂量效应。

美芬妥英：美芬妥英是临床常用广谱抗癫痫药，其血药浓度、疗效和不良反应存在显著个体差异，主要与药物代谢及反应的遗传多态性有密切关系。其中CYP2C19基因多态性可引起不同个体服用美芬妥英后出现特异性的药理及毒理作用，造成药物治疗效果的差异。

奥美拉唑：奥美拉唑是目前应用最为广泛的质子泵抑制剂（PPI）之一，能抑制胃酸分泌，但长期大剂量使用将增加患者骨折的危险。在CYP2C19强代谢型人群中，奥美拉唑80%都是由CYP2C19代谢。故此，CYP2C19基因突变型人群使用奥美拉唑的疗效显著低于CYP2C19基因野生型人群。

CYP2C19基因参与的药物代谢还包括普萘洛尔、地西泮、去甲地西泮、舍曲林等，患者对这些药物的敏感性、耐药性以及不良反应状况都与患者本身CYP2C19基因多态性相关。因此根据检测CYP2C19基因型的多态性来选择用药或者选择最小有效剂量治疗方案有重要的临床意义。

目前医院用于CYP2C19基因分型检测的“金标准”是PCR-直接测序法,但直接测序法的敏感性不高，只能检测出突变细胞比率在10-20%以上的肿瘤组织，对于含<10%突变细胞的肿瘤组织以及外周血，常规PCR+直接测序法几乎无能为力。相比于直接测序法，焦磷酸测序的灵敏性更高、成本更低。