[发明专利]一种产酯酶肠杆菌、其酯酶和基因及其在制备紫杉醇手性前体中的应用

说明书

技术领域

本发明具体涉及一种产立体选择性酯酶的肠杆菌，该酯酶蛋白质，编码该酯酶的基因，含有该基因的重组载体和重组表达转化体，所述酯酶及其重组酯酶的制备方法，以及所述肠杆菌整细胞，或所述酯酶，或其重组酯酶作为催化剂在制备紫杉醇手性前体(2S，3R)-苯基缩水甘油酸甲酯中的应用。

背景技术

光学活性的苯基缩水甘油酸甲酯是一种重要的手性砌块，(2S，3R)-苯基缩水甘油酸甲酯可以用于合成抗癌药物紫杉醇的侧链，也可以作为手性药物黄皮酰胺的起始材料。紫杉醇具有良好的抗肿瘤活性，对于卵巢癌、乳腺癌、肺癌、白血病、肠胃癌等多种癌症具有良好的治疗作用，而黄皮酰胺具有促智作用，是一种抗老年痴呆药物。如何获得单一构型的光学纯苯基缩水甘油酸甲酯已成为人们所关注和研究的重要课题。

目前光学纯紫杉醇手性前体苯基缩水甘油酸甲酯的制备方法主要分为化学不对称合成法和酶促拆分法。化学不对称合成法主要是α，β-不饱和酮或酯的不对称环氧化(Journal of Organic Chemistry,2004,69:4216-4226;Chemistry-An Asian Journal,2007,2:257-264和Advanced Synthesis&Catalysis,2009,351:1685-1691)。然而这种方法合成的是(2R,3S)-构型的苯基缩水甘油酸甲酯。酶促拆分法包括苯基缩水甘油酸甲酯的转酯化拆分以及水解拆分两种(Advanced Synthesis&Catalysis,2001,343:721-725和WO Patent2004087932)，苯基缩水甘油酸甲酯的转酯化拆分法选择性低，产物分离困难。Zheng等用恶臭假单胞菌(Peseudomonas putida)整细胞为催化剂，催化苯基缩水甘油酸甲酯的水解拆分，30℃反应12h得到了对映体过量值(ee)为99%的(2S,3R)-苯基缩水甘油酸甲酯(Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic,2006,43:133-136)。尽管如此，该方法底物浓度较低，仅为50～60mM左右、催化剂活性差，反应时间较长，不适宜于工业化应用。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题就是针对现有的酯酶催化紫杉醇手性前体苯基缩水甘油酸甲酯水解拆分反应时酶催化活性偏低、底物耐受性差、反应时间长等问题，提供一种催化活性高、对映选择性好、底物耐受性好、反应时间短的肠杆菌菌株（Enterobacter sp.）ECU 1107以及该酯酶蛋白质，编码该酯酶蛋白质的基因，含有该基因的重组表达载体，含有该载体的重组表达转化体以及该重组酯酶的制备方法。本发明还公开了利用上述肠杆菌菌株、酯酶和重组表达转化体作为催化剂，催化拆分水解反应制备紫杉醇手性前体(2S,3R)-苯基缩水甘油酸甲酯的方法。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之一是：一种肠杆菌（Enterobacter sp.）ECU 1107，其保藏编号为CGMCC No.5981。

本发明人从中国上海、江苏、浙江、山东、黑龙江、海南等省市以及越南顺化等地采集土样，从土壤微生物中经过初筛、复筛和分离纯化，得到一种能够选择性催化苯基缩水甘油酸甲酯对映选择性水解制备(2S，3R)-苯基缩水甘油酸甲酯的肠杆菌，将其命名为肠杆菌（Enterobacter sp.）ECU 1107。该菌株已于2012年4月10日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.5981。

本发明所述的肠杆菌具有如下微生物学特征：

（1）形态特征：

短杆菌，革兰氏染色阴性，具有周身鞭毛帮助运动，大小约为长1.2～3.0μm、宽0.6～1.0μm。

（2）固体平板培养基上的菌落特征(30℃培养48h)：

该菌株呈粘液状，湿润、光滑，乳白色。

（3）生长环境：

该菌株可在温度15～40℃范围内生长，在pH5～9，NaCl浓度0～7%(w/v)的环境中生存。