[发明专利]一种极耐热木糖苷酶及其编码基因和应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术及纤维原料水解领域，具体涉及一种极耐热木糖苷酶及其编码基因和应用。

背景技术

木聚糖是植物细胞壁半纤维素的土要成分，是除纤维素之外自然界中最为丰富的可再生资源之一。木糖就存在于半纤维素多缩戊糖中, 是亟待开发的重要可再生资源。如果将半纤维素生物降解为木糖和少量其它单糖, 可以用作基本碳源生产各种发酵产品、工业酒精及糠醛制备等。同时, 木糖的衍生物木糖醇还可作为食品添加剂，如用于口香糖、糖果及于尿病患者的甜味剂等。

木糖苷酶是木聚糖降解酶系中的较为关键的多糖水解酶，通过随机切割木寡糖的β-1,4-糖苷键，将木寡糖降解为木糖。由于木糖苷酶可以将寡糖降解为木糖，因此可作为一种高效的工业酶制剂用于木糖及木糖衍生物的生产，因此具有潜在的应用价值。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种极耐热木糖苷酶，以使其满足使用要求。本发明的另一目的是提供一种编码上述极耐热木糖苷酶的核苷酸序列。本发明还有一目的是提供上述一种极耐热木糖苷酶的应用。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种极耐热木糖苷酶，氨基酸序列如SEQ NO：1所示。

一种极耐热木糖苷酶，氨基酸序列为权利要求1所述的SEQ NO：1序列中的氨基酸经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失及添加形成的具有木糖苷酶活性的衍生蛋白质。

一种编码上述的极耐热木糖苷酶的基因， DNA序列如SEQ NO：2所示。

一种可表达上述的极耐热木糖苷酶的重组体系，在所述的重组体系上克隆有如SEQ NO：2所示的DNA序列；所述的重组体系包括重组质粒和重组菌。

一种扩增上述的编码极耐热木糖苷酶的基因的方法，所使用的引物对为：

Xylo-1：5’- GGAATTCCATATGGATCTTTACAAGAATCCAAATGTAC-3’；

Xylo-2：5’-CCGCTCGAGCTCGATCTTTGTATTTGTGAAGAAAAC-3’。

上述的极耐热木糖苷酶在酶解木寡糖中的应用。酶解反应温度为75-100℃，pH5.0-7.5。所述的木寡糖来源于纤维原料中的半纤维素，包括木二糖、木三糖和木四糖。

上述的重组体系在酶解木寡糖中的应用。

上述的极耐热木糖苷酶在酶解玉米秸秆的木寡糖中的应用。

有益效果：与现有技术相比，本发明所提供的木糖苷酶具有优良的耐热性能。在95℃、pH为6.0的条件下酶活性最高，比酶活达到117.6U/mg；该蛋白酶在温度为75-100℃、pH为5.0-7.5的范围内，均具有较高的酶活。该木糖苷酶的耐热性能极高，在85℃反应体系中，保温1h 酶活性基本保持不变。上述特性使得本发明得到的木糖苷酶比现有木糖苷酶具有更大的优越性，适用于80℃以上高温、偏中性的pH条件下木寡糖的降解，具有潜在的工业应用价值。

附图说明

图1是木糖苷酶Tth xylo的SDS-PAGE蛋白电泳图；

图2是Tth xylo的最适温度结果图；

图3是Tth xylo的最适pH结果图；

图4是Tth xylo的热稳定性结果图；

图5是Tth xylo降解玉米秸秆半纤维素TLC图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

以下实施例中所使用的材料、试剂等，若无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1 嗜热陆地热泉高温神袍菌基因组DNA的提取

采用嗜热陆地热泉高温神袍菌Thermotoga thermarum DSM5069（购自德国微生物菌种保藏中心）新鲜菌体10g，悬于5mL 50mM Tris缓冲溶液中（pH8.0），混匀后在37℃放置20min，然后加入2mL 10%SDS，55℃放置5min，用等体积的酚-氯仿（24:1）抽提一次，取上清液加入2倍体积的无水乙醇，于-20℃放置30min，4℃ 13000rpm离心20min，收集沉淀。沉淀溶于0.5mL TE缓冲液（pH8.0，10mM Tris，1mM EDTA），加入10mg/mL RNase 3μL，37℃保温1h，用等体积的酚-氯仿（24:1）抽提一次，取上清加入2倍体积的无水乙醇，于-20℃放置30min，4℃ 13000rpm离心20min，收集沉淀，真空冷冻干燥，用0.5mL超纯水溶解。