[发明专利]寡雄腐霉发酵液制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物发酵技术领域，特别是涉及一种寡雄腐霉发酵液制备方法及其使用该发酵液有效控制烟草黑胫病的方法。

背景技术

黑胫病（Phytophora nicotiana Breda deHaan）是我国烤烟的常见病害，发病率高，分布广泛，危害严重。除黑龙江省之外，全国各地均有发生，常年发病面积占当年烤烟种植面积的18%，严重影响烤烟的产量、质量和经济效益。目前，化学农药是防治烟草黑胫病的主要手段。黑胫病病原菌的小种甚多，对化学农药的敏感性不一样，且容易产生抗药性，多种化学药剂对黑胫病的防治效果随施药时间的延长而降低。此外，这些化学药剂的残效期长，残留量高，影响烟叶安全性。所以，在烤烟栽培中，安全、高效地防治烟草黑胫病是迫切需要解决的生产问题。

寡雄腐霉（Pythium oligandrum）能有效抑制番茄葡萄灰霉病、黄瓜的种腐和苗期猝倒病等多种病原真菌的生长繁殖。在欧洲发达国家，人们已制备出对人畜和环境无毒且高度安全的寡雄腐霉卵孢子制剂，广泛应用于绿色水果和蔬菜生产。但寡雄腐霉形成卵孢子，人工产孢困难，限制了寡雄腐霉的普遍应用，目前，北京比奥瑞生物科技有限公司从捷克引进了寡雄腐霉卵孢子制剂（菌株：Pythium oligandrum DV 74），为寡雄腐霉防病制剂的后续开发与应用奠定了基础。众所周知，卵孢子的萌发和菌丝生长与环境条件密切相关。作为一种微生物制剂，大田应用寡雄腐霉卵孢子时，气温、湿度、光照（尤其是紫外线强度）、降雨、营养环境等均影响卵孢子的萌发和菌丝生长。此外，田间条件易于变化，难以提供寡雄腐霉卵孢子萌发和菌丝生长的合适环境，故卵孢子制剂在实际应用中稳定性极差。通过发酵工程生产其具有生防作用的次生代谢产物，在田间应用时不仅可以提高防治效果，还可克服微生物菌剂效果不稳定的常见缺点。因此，利用优良高产寡雄腐霉菌株，优化发酵条件制备生防发酵液可能更好、更可靠地防治烟草黑胫病。迄今为止，国内外尚无寡雄腐霉发酵液制备方法的研究报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种寡雄腐霉发酵液制备方法及发酵液的施用方法，为有效控制烟草黑胫病提供技术支持。

本发明选用北京比奥瑞生物科技有限公司从捷克引进的“多利维生．寡雄腐霉”卵孢子制剂（菌株：Pythium oligandrum DV 74），该产品已在欧盟、美国、加拿大、巴西等国家正式登记，并于2009年在我国农业部登记（登记号：LS20091213），还获得欧洲FiBL和美国OMRI有机认证。

本发明所述的一种寡雄腐霉发酵液制备方法，通过以下步骤实现：

（1）寡雄腐霉菌种的获得

将“多利维生．寡雄腐霉”卵孢子制剂用无菌水稀释10³~10⁵倍，改进马丁氏（Martin）琼脂培养基100°C 溶化摇匀，取5 mL培养基于25 mL试管中，121°C 蒸汽灭菌30分钟，冷却至45°C，每支试管加入16.5 mL 1%孟加拉红无菌水溶液和15 mL 1%链霉素无菌水液，摇匀，倾斜放置制备斜面；接入稀释后的寡雄腐霉卵孢子，25°C暗培养10~12天，挑选出寡雄腐霉菌丝，并用上述培养基和培养方法扩繁菌丝；

改进马丁氏（Martin）琼脂培养基：1 g KH₂PO₄、0.5 g MgSO₄·7H₂O、5 g 蛋白胨、10 g葡萄糖、5 g 酒石酸铵、1 g 琥珀酸、20 g琼脂 、1000ml水、pH5.5-6.0；

（2）寡雄腐霉发酵液的制备

（2.1）培养基：种子罐培养基：2%玉米粉，1%葡萄糖，0.25%酒石酸铵，0.1%琥珀酸，余量为水，初始pH5.5-6.0；二级罐培养基：同种子罐培养基；发酵罐培养基：2%玉米粉，1.5%葡萄糖，0.5%酒石酸铵，0.2%琥珀酸，余量为水，初始pH5.5-6.0；