[发明专利]快速检测皮革真实属性的试剂盒及其方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种快速检测皮革真实属性的试剂盒及其方法。

背景技术

PCR是聚合酶链式反应的简称，是分子生物学中广泛运用的一项技术，主要原理是通过热循环，达到目的基因片段的大量扩增。目前这项技术越来越广泛地运用于产品检测之中。例如，运用PCR技术检测牛奶或腊肠中的植物成分等，运用PCR技术检测肉骨粉等产品中的动物源性成分等，运用PCR技术检测食品中的转基因成分等。

皮革主要是由哺乳类动物毛皮加工而成，是我国重要的出口创汇产品。天然皮革按其动物来源种类分，主要有牛皮革、羊皮革、猪皮革、马皮革、兔皮革等。由于天然皮革种类繁多，价格昂贵，一些不法商贩为了寻求利益的最大化，以人造革冒充天然皮革，或以低档皮革冒充高档皮革，损害了广大消费者的健康和利益，对社会经济以及皮革产业发展产生了不利的影响。

目前，国内外皮革材质的鉴别主要仍以手摸眼看的感官鉴定方法为主，随着皮革加工技术的提高，在某些方面，感官鉴别方法已很难鉴别出皮革种类，急需开发更为科学有效的方法。

发明内容

基于此，本发明提供了一种快速检测皮革真实属性的试剂盒及其检测方法。该试剂盒主要是依据不同种类皮革所承载的遗传信息存在差异，通过基因检测技术特异性地分析皮革样品中的DNA信息来区分皮革种类。

一种快速检测皮革真实属性的试剂盒，包括：

(1)DNA提取缓冲液

所述DNA提取缓冲液的组成为：15～25mg/L十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)、90～110nmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)、15～25mmol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA₂Na)、1.3～1.5mol/L氯化钠(NaCl)、0.09～0.12g/L蛋白酶K，0.9～1.1mol/L二硫苏糖醇(DTT)；

(2)Taq DNA聚合酶，所述Taq DNA聚合酶的浓度为125IU；

(3)PCR反应液

所述PCR反应液的组成为：2.7～3.3mmol/L氯化镁，0.3～0.5μmol/L引物，0.3～0.5mmol/L的三磷酸脱氧核苷酸；

所述引物为针对动物源性基因序列的通用引物SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2；

(4)上样缓冲液

所述上样缓冲液的组成为：2.0～3.0g/L溴酚蓝、350～450g/L蔗糖。

在其中一些实施例中，所述引物还包括针对牛、羊、猪、马或兔的线粒体基因序列的引物。

在其中一个实施例中，所述针对牛线粒体基因序列的引物为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4。

在其中一个实施例中，所述针对羊线粒体基因序列的引物为SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。

在其中一个实施例中，所述针对猪线粒体基因序列的引物为SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8。

在其中一个实施例中，所述针对马线粒体基因序列的引物为SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10。

在其中一个实施例中，所述针对兔线粒体基因序列的引物为SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12。

一种快速检测皮革真实属性的方法，采用上述试剂盒，包括以下步骤：

(1)制备样品DNA

剪取50cm²左右的经酒精浸泡消毒后的皮革样品，放入碎皮机中破碎，使用磷酸盐缓冲溶液在不断振荡的条件下浸泡皮革样品12～16小时，期间每隔2～3小时换一次溶液，以降低皮革试样中的盐离子如铬离子等的含量；浸泡后将皮革样品再次破碎，取3mL破碎的样品，加入2mL DNA提取缓冲液，混匀。将离心管置于65℃放置45～60min，不时摇动，使样品充分裂解；取出，加入1mL饱和氯化钠溶液，剧烈振荡3～5min，置于0℃下放置5～10min，离心；取上清，用体积比为25∶24∶1的苯酚∶氯仿∶异戊醇混合液进行提取，离心；取上清，用体积比为24∶1的氯仿∶异戊醇混合液进行提取，离心；取上清，加入异丙醇沉淀核酸，-20℃放置2～4小时，使得异丙醇与核酸充分反应，高速离心，获得DNA沉淀；再用70％的乙醇溶液洗沉淀物，沉淀物加水溶解，即得样品DNA；

(2)PCR扩增反应