[发明专利]焦磷酸测序法检测IRF4基因多态性的试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体的是涉及焦磷酸测序法检测IRF4基因多态性的试剂盒及方法。 

背景技术

慢性淋巴细胞性白血病(Chronic lymphocytic leukemia, CLL)是影响血液和骨髓的重要癌症之一。在慢性淋巴细胞性白血病时，淋巴细胞(身体内一种抗感染的白血球)不能正常工作。随着时间的推移，有缺陷的淋巴细胞积聚并减少正常的白细胞数目。慢性淋巴细胞性白血病的危险因素尚未完全阐明。慢性淋巴细胞性白血病呈家族性遗传，这表明遗传因素在该病的发生中扮演着重要角色。研究发现，位于人染色体6p25.3上IRF4基因的3’UTR的rs872071为慢性淋巴细胞白血病的风险变异，rs872071基因突变通过降低IRF4表达，阻止记忆B细胞转换，从而增加患病风险(Nat Genet. 2008, 40(10):1204-10) 。 

IRF4基因rs872071位点有3种基因型，AA、AG和GG。G等位基因在普通人群中比例大约为52%，而在慢性淋巴细胞性白血病患者中的比例可达70%。目前多个研究报道证实IRF4基因rs872071的G突变是慢性淋巴细胞性白血病的重要危险因素之一。AG和GG基因型携带者患慢性淋巴细胞性白血病的风险分别为AA基因型的214%和297%。在中国人中进行的大样本研究结果显示，IRF4基因rs872071位点携带一个G等位基因的个体发展为慢性淋巴细胞性白血病的风险是无G等位基因个体的231% (European Journal of Haematology 2010, 85:492-495)。 

通过检测IRF4的基因型，可了解是否为慢性淋巴细胞性白血病易感人群，继而从病因学延缓慢性淋巴细胞性白血病的发生、发展；高危人群定期检查，以便早诊断、早治疗、最大程度的降低疾病造成的损害。对于IRF4基因检测高患病风险的人群，应该在饮食、生活、运动、保健、健康体检等方面进行科学合理的安排，以达到降低慢性淋巴细胞性白血病患病风险。 

综上，IRF4基因多态性对慢性淋巴细胞性白血病疾病的风险评估，尤其是一些特殊人群患病的预测，具有重要的临床意义。开发快速、高效、准确、便捷、经济的检测IRF4基因多态性检测试剂盒将为慢性淋巴细胞性白血病的发生起到预测、预防作用。 

焦磷酸测序(Pyro sequencing)技术是新一代DNA序列分析技术，该技术无须进行电泳，DNA片段也无须荧光标记，是一种通用型技术平台。该技术具有操作简便、检测成本低、所需样品量小、快捷、准确、高通量等特点，符合临床大样本检测要求。 

发明内容

本发明旨在提供一种焦磷酸测序法检测IRF4基因（SEQ ID NO.1）多态性的试剂盒及方法，以实现快速、简便、准确、高效、实用、经济的检测IRF4 SNP。 

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为： 

一种焦磷酸测序法检测IRF4基因多态性的试剂盒，包括如下引物：

（1）扩增引物：

     上游引物：5’-CCGTTTTTGAGACTGATCTCG-3’（SEQ ID NO.2）；

     下游引物：5’-CGGGAATTTCCATTGGAGG-3’（SEQ ID NO.3）；

     其中，下游引物的5’进行生物素标记；

（2）测序引物：5’-GGCCCTTCTCTCACG-3’（SEQ ID NO.4）；

试剂盒中其他试剂及溶液为PCR和DNA焦磷酸测序的常规试剂。

一种应用上述试剂盒检测IRF4基因多态性的方法，包括如下步骤： 

（1）DNA提取；

（2）聚合酶链反应：

配制50μl PCR扩增体系，包含：10×PCR buffer 5.0μl， dNTP 1.5μl， IRF4-上游引物 0.5μl， IRF4 (rs872071)下游引物0.5μl， rTaq0.5μl，水41.0μl，模板1.0μl；循环程序为：95 ^oC 5min预变性；依次在95^oC 30S，52^oC 30S，72^oC 30S，进行40个循环；72^oC 保持5min，最终保持在4 ^oC，得扩增产物；