[发明专利]检测新布尼亚病毒的试剂盒和寡核苷酸

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测新布尼亚病毒的试剂盒和寡核苷酸，尤其是利用SYBR Green荧光定量PCR方法对生物样品中新布尼亚病毒进行检测。属生物技术领域。

背景技术

新布尼亚病毒(Novel Bunyavirus)属于布尼亚病毒科（Bunyaviridae），白蛉热病毒属（Phlebovirus）。病毒基因组包含三个单股负链RNA节段（L、M和S）。

新布尼亚病毒导致发热伴血小板减少综合征，主要临床表现为高热，伴乏力、明显纳差、恶心、呕吐等，部分病例有头痛、肌肉酸痛、腹泻等。少数病例病情危重，出现意识障碍、皮肤瘀斑、消化道出血、肺出血等，可因休克、呼吸衰竭、弥漫性血管内凝血（DIC）等多脏器功能衰竭死亡。

新布尼亚病毒是我国新发现的一种布尼亚病毒，曾在河南、湖北、山东等省的山区和丘陵地带发现病例。目前已从患者以及蜱中分离到了该病的病原体，提示可以经蜱叮咬传播，但直接接触急性期病人血液，也会导致感染，人群普遍易感。本病尚无特异性治疗手段，主要为对症支持治疗。

目前，通过病毒分离、血清特异性IgG抗体、血清特异性总抗体等方法来确诊新型布尼亚病毒感染。病毒分离堪称病毒检测的“金标准”，但操作复杂，技术要求高，检测周期长，无法及时为临床诊断提供结果，且敏感性较差，病毒分离阴性并不能排除病毒的感染。血清学方法操作简单，但是存在较长“窗口期”，不利于早期诊断，而且敏感性较核酸诊断明显要低。

病毒核酸是病毒感染最直接、最敏感和最特异的检测指标。PCR方法以其高敏感性、高特异性和快速简便等优势得到了广泛的应用。目前在临床检测中使用较多的是荧光定量PCR，荧光标记探针的使用进一步提高了检测的敏感性和特异性，但是成本相对较高。而SYBR Green实时定量检测法成本较低，又同时实现了反应体系的全封闭和操作的全自动，减少了污染，提高了效率，而且不受生物个体因素影响，具有高度灵敏度、特异性，可以进行单个或成批样品的检测，适合基层单位的推广，已成为病毒的常规检测方法。本发明研究开发出一种检测新布尼亚病毒的SYBR Green实时定量检测试剂盒，该试剂盒使用方便，可广泛应用于新布尼亚病毒的临床及实验室检测。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一组特异性强、灵敏度高的用于检测新布尼亚病毒的寡核苷酸。

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种操作简单、结果准确的检测新布尼亚病毒的试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了一组检测新布尼亚病毒的寡核苷酸，由序列表SEQ ID No.1至序列表SEQ ID No.2所示碱基序列的寡核苷酸组成；

1）上游引物5’-ATCCTCAACCTCTCTGTCACCATAC-3’（SEQ ID NO：1）

2）下游引物5’-ACGGCTCCTTCTTCCCAAA-3’（SEQ ID NO：2）

本发明还提供一种检测新布尼亚病毒的试剂盒，包括以下试剂：

1）RT-PCR反应液，其包括：Takara ExTag HS Mix、PrimerScript PLUS RTase、缓冲液、上游引物、下游引物、Rox染料，其中上游引物是序列表SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，下游引物是序列表SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；

2）DEPC水；

3）阴性对照：不含布尼亚病毒的蜱cDNA；

4）阳性对照：布尼亚病毒cDNA或含布尼亚病毒目的基因的质粒；

其中，Rox（50×）染料，购自宝生物工程（大连），货号DROX01。

缓冲液（2×）（购自宝生物工程（大连）有限公司，货号DRR096A）含有dNTP Mixture2×conc,4mM Mg2+,SYBR Green I等；

Takara ExTag HS Mix（购自宝生物工程（大连）有限公司，货号DRR096A）含有TaKaRa Ex Taq HS 1.25U/25μl和辅助蛋白。

PrimerScript PLUS RTase（购自宝生物工程（大连）有限公司，货号DRR096A）内含反转录酶和RNase抑制剂。

本发明还提供了一种检测新布尼亚病毒的试剂盒的使用方法：

1）提取待检样品的RNA，即模板RNA，可以利用现有技术中已知的方法或试剂盒提取；

2）进行SYBR Green荧光定量RT-PCR扩增反应，该反应体系见下表：

表1反应体系