[发明专利]美丽鸡血藤EST-SSR标记

说明书

技术领域

本发明涉及一种分子标记技术，具体涉及一种美丽鸡血藤EST-SSR遗传标记，适用于美丽鸡血藤的遗传多样性研究，种质鉴定和亲缘关系分析。

背景技术

微卫星序列（microsatellite DNA）又称为简单序列重复（simple sequence repeats，SSR），是指以1-6个核苷酸为基本重复单位的串联重复序列，广泛存在于各类真核生物基因组中。SSR具有丰富的多态性且均匀分布于整个基因组、以孟德尔方式遗传、操作简单、共显性和重复性好，可进行自动化分析，并用于干燥样本的分析等优点。微卫星位点可以提供具高分辨率的遗传信息，这一特点使微卫星既适合于个体水平上的研究，又适合于种群水平上的研究。在个体水平上包括个体识别、交配系统和亲本分析、基因流等研究；在种群水平上微卫星可用于遗传结构、有效种群大小、种群的系统发育重建等研究。毋庸置疑，SSR 标记目前已成为居群遗传学最流行的分子标记，但是，由于SSR 标记具有种属特异性，当所研究的目标物种缺乏前期研究基础而无法获得现成的SSR 分子标记时，需要对其进行分子标记开发工作。采取实验室手段开发SSR 引物费时，耗力，成本高，试验复杂，基于现有转录组数据库信息进行SSR 引物开发将是一种既经济又有效的方法。从表达序列标签（expressed sequence tag，EST）中开发SSR标记（EST-SSR）是近年来发展起来的新型分子标记，与基因组SSR相比，它反映了基因组的编码区域，可以直接获得基因表达的信息，有可能对决定重要表型性状的等位基因进行直接鉴定；充分利用了现有测序数据，降低了开发成本；在不同物种间通用性好，具有较高的转移性。自2000年起，已相继水稻、小麦、马铃薯、葡萄、核桃、甜瓜等多种植物上开展了EST-SSR标记开发，并广泛用于遗传图谱构建、遗传多样性分析、功能基因定位、比较作图等研究。

美丽崖豆藤（Callerya speciosa Champ.），为豆科蝶形花亚科鸡血藤属多年生藤状灌木植物，是一种分布于热带和亚热带地区的野生名贵南药，具有悠久的药用历史，以根入药（药材名：牛大力），主治风湿性关节炎、腰肌劳损、慢性支气管炎、慢性肝炎、遗精、白带等，广泛地应用于多种中成药方剂的配制（《全国中草药汇编》编写组，1996），此外，还可用于熬制靓汤，药食兼用，具有极大的开发利用价值，是一种重要的经济药用植物资源。然而，我国美丽崖豆藤的人工驯化栽培才刚起步，其药材原料主要依赖野生资源，随着市场需求的与日俱增，长期的供不应求带来的掠夺性开发和不合理采挖，已经造成美丽崖豆藤种质资源的极大破坏，广西、广东的野生资源已经濒临枯竭，海南尚有一定的野生资源，但其蕴藏量也十分有限，多呈斑块状零星分布。目前，国内需要的牛大力药材多从越南进口，但产地国开始采取措施保护本国的生态环境和资源，限制了出口量，这将在很大程度上影响我国对牛大力的用药需求。可见对美丽鸡血藤野生资源的保护已迫在眉睫了，但要制定切实有效的保护计划，就必须了解野生种群结构和遗传多样性等方面的信息。

现有的通用型分子标记，如RAPD、ISSR等，存在重复性差的严重缺陷，为显性标记且存在共迁移缺点； AFLP虽然具有多态性高，重复性好，稳定可靠和选择中性等优点，但仍为显性标记且操作难度大。相比而言，SSR操作简单，客观明确，选择中性和呈共显性的孟德尔式遗传，能够鉴别杂合体，对隐性性状的选择十分有利，它具有比其它分子标记（如等位酶、RFLP、RAPD等）更多的可检测等位基因，能够提供更细致的基因变化分析范围。但美丽鸡血藤的SSR标记尚未见报道。

发明内容

　   本发明的目的在于提供一种美丽鸡血藤的EST-SSR分子标记，建立美丽鸡血藤微卫星的技术体系并利用这套分子标记进行美丽鸡血藤的遗传多样性研究和亲权关系鉴定。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：提供一种美丽鸡血藤EST-SSR标记，其特征在于：所述的微卫星标记编号为：Ndl_001、Ndl_002、Ndl_003、Ndl_004、Ndl_010、Ndl_011、Ndl_013、Ndl_015、Ndl_019、Ndl_020、Ndl_021、Ndl_022、Ndl_028、Ndl_031、Ndl_032、 Ndl_033、Ndl_038、Ndl_042、Ndl_043、Ndl_047、Ndl_049、Ndl_050、Ndl_051、Ndl_053；

其核苷酸序列分别为：

Ndl_001：