[发明专利]一种检测肠道病毒71型RNA的方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明提供一种提取纯化和检测肠道病毒71型（Human enterovirus 71，EV71）RNA的方法，并提供一种相应的检测EV71 RNA的试剂盒。

背景技术

EV71是引起婴幼儿手足口病常见的病毒，学龄前儿童对EV71普遍易感，且发病急、进展快。成人亦有感染，一般表现为隐性带毒，可传染给婴幼儿而引起发病。

与其他肠道病毒相似，对EV71感染进行诊断与分类的方法在现阶段一般是通过采集适当的临床标本后进行病毒分离和病毒鉴定；如果没有采到合适的临床标本，或无法进行病毒分离，也可以通过血清学检测（如中和实验）来检测血清中的中和抗体，或直接从临床标本中检测病毒的核酸来诊断。

由于病毒分离培养较困难，加之感染后IgG抗体存在时间长，再感染时IgM和补体结合抗体又常为阴性，故有时血清学实验较难区分初次感染和再次感染，而特异性核酸的检测不失为快速、明确的诊断手段。

实时荧光PCR技术（FQ-PCR）把PCR、分子杂交和光化学融为一体，使PCR扩增和产物分析的全过程均在单管封闭条件下进行。实时荧光PCR技术与其它检测技术相比具有以下优势：（1）与免疫学检测比较，其具有更高的灵敏度，从理论上讲只要有一个基因拷贝就可以检测出来。（2）根据各种病原体独特的保守基因序列设计引物，能够保证PCR反应的高度特异性，避免交叉反应。（3）能对病毒进行定量检测，可反映出患者体内病原体拷贝数的高低和复制情况。定量检测有助于判断病原体感染与疾病发生和发展的关系，探讨药物对病原体的作用，了解感染疾病病人用药后病情的变化情况。这对理解发病机制和预测抗病毒治疗的有效性十分关键。（4）可扩大检测人群的范围，适用于大规模的流行病调查。对如手足口病这类自然感染率极高的病原微生物尤其适用。（5）将PCR敏感性与探针特异性相结合，在很大程度上改变了传统PCR的缺陷，缩短了反应时间，简化了操作步骤（6）全过程均在单管封闭条件下进行，避免了由于样本间交叉引起的假阴性和环境污染（7）实时检测技术可连续不断的检测PCR过程中荣耀信号的变化，避免了传统PCR的“平台期效应”，并且模板的定量不通过终产物，而由Ct值算出，准确性和灵敏性都有提高。

目前，国内已有多种基于实时荧光定量PCR技术定量检测EV71-RNA的试剂盒应用于临床检测中，这些试剂盒所提供的EV71-RNA提取方法主要是酚-氯仿法和柱提取法。该类试剂盒存在很多不足之处：1）检测灵敏度低，约在1000copies/ml左右；检测范围窄，一般在1.00E+03copies/ml~1.00E+07copies/ml之间，对于临床高值（大于5.00E+07copies/ml）和低值（小于1.00E+03copies/ml）的样本无法检测；2）无法有效检测肠道病毒71型A、B、C的各亚型样本，经常有漏检情况的发生；3）酚-氯仿法是最经典的RNA提取方法，但是操作繁琐，对于设备和人员操作要求高，低病毒载量的标本检出率低，且所用试剂具有一定的毒性；柱提取方法无需高速离心，但是需频繁更换离心管，用时长，特异性较差；4）无法有效去除样本中的PCR抑制物（如全血、痰液等），体系中一般没有阳性内对照（即内标），无法预防假阴性；5）国外性能优异的同类试剂是Biomerieux,inc.的NucliSENS Easyq Enterovirus System试剂。该试剂成本和耗材成本太高，很难在临床广泛开展。

磁珠（免疫磁珠）法是近年发展迅速且被广泛应用的一种核酸提取方法，其优于传统方法的特点可以总结为以下几点：其系列试剂不含氯仿、苯酚等毒性大的有机溶剂；提取纯化的核酸质量好、产量高；提取步骤更简单，不需要离心，易于实现自动化；这些优点使其有替代其它核酸提取和纯化方法的发展趋势。但在现有技术中，并未见有磁珠法用于提取纯化和检测EV71 RNA的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于解决现有肠道病毒71型核酸检测试剂盒的缺陷，提供一种RNA提取得率高、检测灵敏度高的肠道病毒71型核酸检测试剂盒，应用该试剂盒，可以对咽拭子、粪便等未知样本中的EV71-RNA浓度进行快速、准确测定，为早期诊断肠道病毒71型感染提供可靠的实验依据。

本发明用磁珠法提取样本核酸，采用实时荧光定量PCR技术，以EV71基因组的高度保守区域为扩增靶目标，设计特异性引物及TaqMan探针，在实时荧光PCR仪上通过PCR扩增对EV71 RNA进行定性检测。

本发明提供一种检测EV71 RNA的方法，其中使用磁珠法提取和纯化EV71 RNA。