[发明专利]实时荧光定量检测猪鼻支原体的引物和探针

说明书

技术领域

本发明涉及一种实时荧光定量检测猪鼻支原体的引物和探针，特别是用于猪鼻支原体的实时荧光定量PCR检测，属于生物技术领域。

背景技术

猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis)是一种能够引起猪多发性浆膜炎、关节炎、耳炎、肺炎等病症的致病性支原体。猪鼻支原体不仅在猪群中普遍存在，同时也是人类和多种动物细胞培养中常见的污染物。作为一种常见病原菌，猪鼻支原体通常由母猪或大猪传染给小猪。已有研究者证实了能从10%母猪和30%～40%断奶仔猪的鼻腔分泌物中分离出该支原体。一旦感染，该支原体在上呼吸道迅速传播并且能从感染猪的肺脏和鼻咽管中分离到。在英国和美国的慢性猪肺炎案例中，50%以上都能检测到猪鼻支原体的存在；同时在地方性肺炎暴发群中几乎每次都能够分离到猪鼻支原体。从捷克斯洛伐克、丹麦、德国和英国分离出的几株猪鼻支原体通过呼吸道途径能诱发猪肺炎。猪鼻支原体的三株捷克斯洛伐克分离物和一株英国分离物,可诱导无菌小猪发生肺炎。国内宁夏农学院曾以两株疑似猪鼻支原体（宁农3和宁农5）培养物滴鼻接种小猪，诱发轻度肺炎。台湾林俊宏用猪鼻支原体分离株ATIT-1、3、7混合物气管内注射可以诱发部分攻毒猪发生典型的猪支原体肺炎病变，并成功从大部分攻毒猪肺中分离到猪鼻支原体。另外，研究表明，猪鼻支原体与人类的肿瘤发生有关。

迄今为止，对猪鼻支原体的检测方法有培养法、血清学检测方法等，而对猪鼻支原体检测主要以分离培养为主，所需要的时间较长，亟需建立一种敏感性高的、快速的、等量的分子生物学检测方法。本发明提供了猪鼻支原体实时荧光定量PCR的引物和探针，有助于快速、定量诊断猪鼻支原体的感染。

发明内容

技术问题

本发明的目的是为了克服现有的以分离培养为主对猪鼻支原体检测的时间长、无法准确定量的缺陷，提供一种能快速、灵敏、准确、定量检测猪鼻支原体的实时荧光定量PCR检测方法。

技术方案

一种快速检测猪鼻支原体的荧光定量PCR引物和探针，

引物1：P37-F  5′-AGAAGGTTCTTTTGCTTGAACACA-3′

引物2：P37-R  5′-TGCTTCCATCTTTTCATTTGCTT-3′

分子信标探针：5’-FAM-ATCAGCAACAAAACCTT-MGB-3’

检测过程中PCR扩增反应体系为：

反应条件为：95℃预处理10min，进行40个循环反应，每个循环反应包括95℃15s，53℃1min，于53℃时测定荧光值。

用所述的引物对和分子信标探针可以制备猪鼻支原体的荧光定量PCR检测试剂盒。

有益效果

本发明与现有技术相比具有以下优点和效果：

1、定量准确；

2、检测速度快，仅1小时，加上DNA提取的制备，共仅需3-4h；

3、步骤简单；

4、可同时进行高通量的样品检测。

在本发明提供检测猪鼻支原体荧光定量PCR的引物和探针，将其用于猪鼻支原体定量检测，建立了检测猪鼻支原体荧光定量PCR的方法，该方法的灵敏度可在每个反应体系中检出10拷贝，完全可以满足快速鉴定诊断猪鼻支原体的要求。

附图说明

图1不同拷贝数阳性质粒荧光PCR扩增的动力学曲线。分别以模板数为1.0×10⁸-1.0×10¹拷贝/ml及水为阴性对照进行Taqman PCR分析。

图2显示猪鼻支原体荧光定量PCR的标准曲线。针对模板数为1.0×10⁸-1.0×10¹拷贝/ml的反应体系进行Taqman PCR分析。当猪鼻支原体个数为1.0×10¹时，检测样品的Ct值为34左右，即检测下限灵敏度可达1.0×10¹拷贝/ml。绘制得到的标准曲线的斜率为-3.121，在Y轴截距为38.243，相关系数R²=0.999。

具体实施方式：

试剂包括a）DNA裂解液，b）Taq DNA聚合酶，c）标准阳性模板，d）荧光定量反应液，其特征是：