[发明专利]一种可分泌纤维素酶的菌株及其纤维素酶提取方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物领域，具体地说是一种可分泌纤维素酶的菌株的分离方法、该菌株产纤维素酶及其提取方法及应用。

背景技术

纤维素是自然界中分布最广泛的多糖类物质。如能合理利用使其降解为可利用的糖类，可解决当前人类社会所面临的粮食与能源问题。纤维素酶是水解纤维素为可发酵性糖的关键酶，纤维素被水解后可得到还原性糖，从而通过发酵工艺进一步转化为生物能源等物质。在草料中添加纤维素酶，可增加饲料的利用率，提高饲养动物的产肉率。目前纤维素酶还被广泛用于多纺织、造纸等工业领域。

用于产纤维素酶的真菌多为里氏木霉。当前纤维素酶多由微生物发酵生产。但酶活产量低，成为纤维素酶工业化的最大阻力。寻找高效纤维素酶产生菌极为重要。

发明内容

本发明的目的是为了解决上述技术问题，提供一种可分泌酶活高、产量高的纤维素酶的产酶菌株。

本发明的另一目的还提供上述菌株的分离方法。

本发明的同时还提供一种上述菌株分泌的纤维素酶的提取方法及其应用。

本发明可分泌纤维素酶的菌株为绿木霉ZY-01，保藏名称为绿木霉(Trichoderma virens ZY-01)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No： M 2012205，保藏日期为2012年6月5日，该菌株18s rDNA序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

Trichoderma virens ZY-01(CCTCC No： M 2012205)的具体特征如下：

(1)菌落形态

菌丝层较厚，致密丛束状，初期为白色，平坦，后期因产生孢子，而成绿色。菌落背面无色，或逐渐呈暗黄色。

(2)水解圈特性

在刚果红培养基上有较大明显水解圈。

(3)细胞形态

菌丝透明至浅绿色，壁光滑，分生孢子梗由菌丝侧面生出，基部通常不育，且不分枝，向顶分枝不规则，整体像树枝。厚垣孢子呈卵圆形，光滑，淡绿色。

18s rDNA序列分析表明该菌株(Trichoderma viride ZY-01)与模式菌株Trichoderma atroviride [M] 206040和Trichoderma virens Gv29-8的序列同源性为99 %，结合形态学特征和培养特征分析，该菌有绿木霉的特性，该菌归为木霉属(Trichoderma sp.)。

上述可分泌纤维素酶的菌株的分离方法，包括下述步骤：

1)从秸秆作物农田取得土壤，加水振荡后使土壤与无菌水充分混合散开，静置使其澄清，取上清液；土壤和无菌水的混合质量体积比优选为1：9。

2)将上清液滴加于刚果红选择培养基上，涂布均匀，30- 40 ℃恒温培养3- 5天；

所述刚果红选择培养基成分为：KH₂PO₄ 0.2- 1.0 g，MgSO₄·7H₂O 0.2- 0.5 g，琼脂10- 20 g，CMC?Na 1- 5 g，刚果红0.20 g，2 %去氧胆酸钠溶液20 mL，3- 5 mL链霉素溶液，蒸馏水定容至1000 mL；

3)在刚果红选择培养基上培养3- 5 天后，观察水解圈情况，当菌落周围培养基相对无菌落部分的刚果红着色较浅或接近于无色时，则该水解圈指示得到可分泌纤维素酶的菌株。由于该菌株可分泌出胞外纤维素酶并水解菌落周围培养基中纤维素成分，致使菌落周围培养基相对无菌落部分的刚果红着色较浅或接近于无色，由该水解圈指示即说明已得到可分泌纤维素酶的菌株绿木霉ZY-01。

由纤维素酶的产酶及纯化提取方法包括下述步骤：

(1)发酵产酶：

将所述的菌株接种入发酵产酶培养基中发酵产酶，所述发酵产酶培养基成份为：羧甲基纤维素钠(CMC?Na)，酵母抽提物，NaCl，MgSO₄?7H₂O和K₂HPO₄，发酵温度为30- 40 ℃，发酵时间为3- 5天，得到发酵液；

(2)纤维素酶提取：

将发酵液离心分离得到上清液，对上清液进行乙醇(60- 85%)沉淀，再利用葡聚糖凝胶G-75层析，得到纯化后的纤维素酶。