[发明专利]一种可分泌纤维素酶的菌株及其纤维素酶提取方法与应用

权利要求书

1.一种可分泌纤维素酶的菌株，保藏名称为绿木霉ZY-01 (Trichoderma virens ZY-01)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No： M 2012205，该菌株18s rDNA序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的可分泌纤维素酶的菌株的分离和鉴定方法，其特征在于：

1)从秸秆作物农田取得土壤，加水振荡后使土壤与无菌水充分混合散开，静置使其澄清，取上清液；

2)取上清液滴加于刚果红选择培养基上，涂布均匀，30- 40 ℃恒温培养3- 5天；

所述刚果红选择培养基成分为：KH₂PO₄ 0.2- 1.0 g，MgSO₄?7H₂O 0.2- 0.5 g，琼脂10- 20 g，CMC?Na 1-5 g，刚果红0.20 g，2 %去氧胆酸钠溶液20 mL，3- 5 mL链霉素溶液，蒸馏水定容至1000 mL；

3)在刚果红选择培养基上培养3- 5 天后，观察水解圈情况，当菌落周围培养基相对无菌落部分的刚果红着色较浅或接近于无色时，则该水解圈指示得到可分泌纤维素酶的菌株。

3.一种由纤维素酶的产酶及纯化提取方法，其特征在于，包括下述步骤：

(1)发酵产酶：

将权利要求1所述的菌株接种入发酵产酶培养基中发酵产酶，所述发酵产酶培养基主要成份包括：羧甲基纤维素钠(CMC?Na)，酵母抽提物，NaCl，MgSO₄?7H₂O和K₂HPO₄，发酵温度为30- 40 ℃，发酵时间为3- 5天，得到发酵液；

(2)纤维素酶纯化提取：

将发酵液离心分离得到上清液，对上清液采用乙醇沉淀法及葡聚糖凝胶G-75层析法纯化，得到纯化后的纤维素酶。

4.如权利要求３所述的由绿木霉生产纤维素酶的方法，其特征在于，所述步骤(１)的发酵产酶培养基成分比例为：0.5- 2 g酵母抽提物，5- 20 g羧甲基纤维素钠（CMC?Na），20- 30 g NaCl，0.3- 1 g K₂HPO₄，0.3- 1 g MgSO₄?7H₂O，蒸馏水定容至1000 mL。

5.一种纤维素酶，由权利要求３或4所述的提取及纯化方法得到。

6.权利要求５所述纤维素酶的应用，所述纤维素酶用于高纤维素含量的生物质的高效降解。

7.如权利要求6所述的纤维素酶的应用，所述高纤维素含量的生物质为甘蔗渣、玉米秸秆、稻草或小麦秸杆。

8.如权利要求6或7所述的纤维素酶的应用，其特征在于，所述降解方法为将高纤维素含量的生物质粉碎后用1 %- 3 % (w/v) NaOH预处理，其中固液质量体积比为1：20，随后每1 g预处理后的高纤维素含量的生物质中加入50-70 IU的权利要求5所述的纤维素酶，加入缓冲液调节pH值到4.0- 6.0，40- 60℃恒温酶解20- 50 h。

9.如权利要求8所述的纤维素酶的应用，其特征在于，所述粉碎步骤中，甘蔗渣或玉米秸秆粉碎后过40- 80目，稻草或小麦秸杆粉碎至5 mm以下。