[发明专利]一种杂合肽囊素佐剂及其制备方法和应用

说明书

一、技术领域

本发明属于分子免疫学技术领域，具体涉及一种杂合肽囊素佐剂及其制备方法和应用。

二、背景技术

Lys-His-Gly-NH₂三肽是一种可以诱导B淋巴细胞分化的激素样物质,它不仅可以通过诱导干细胞的分化和作用于B淋巴细胞对机体免疫球蛋白的多样化性产生影响，而且还可以促进机体的IgM向IgG的方向发生变转，因其最早是从鸡法氏囊中提取的，所以称之为囊素三肽。1991年，Aydhya等发现囊素不仅仅存在于禽类法氏囊中，还存在于哺乳动物的骨髓和胆管上皮细胞中。在哺乳动物中分离的囊素是以前囊素状态出现的，它是一种序列为Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Lys-Pro-Arg-Lys-His-Gly-Gly-Arg-Arg的14肽结构。从序列上我们可以看出其第9位、第10位和第11位这三个连续的氨基酸正好是囊素三肽的序列。Aydhya的研究还证实了此14肽的前囊素与囊素三肽有着相似的生物学活性。因此，我们可以推断融合状态的前囊素并不影响三肽生物活性的发挥。

近年来国外对有免疫活性的多肽的序列和结构有详细的研究，其中有一种叫做加加尼翁（Gagnon's peptide）的四肽，其氨基酸序列为：Lys-Asn-Pro-Tyr。这个四肽序列被证实也是B细胞刺激物，可以增加鸡新城疫疫苗等抗体效价。

为了研究重组疫苗免疫佐剂，本研究利用分子生物学的方法设计了14个囊素三肽和2个加加尼翁四肽的杂合序列，并在序列的末端增加了6个组氨酸的标签序列，最终序列长度为197bp，我们命名其为杂合肽囊素N197。通过合成N197的杂合多肽序列以及体外和体内动物实验来验证基因工程免疫增强剂杂合多肽的免疫活性。

三、发明内容

（一）本发明要解决的技术问题是：提供一种可广泛用于疫苗制备，生产成本低，免疫佐剂效果好的新型杂合肽囊素免疫佐剂及其制备方法和应用。

（二）本发明的技术方案是：

1杂合肽囊素N197的设计合成

14个囊素三肽的氨基酸序列（Lys-His-Gly-NH₂）和2个加加尼翁活性四肽的氨基酸序列（Lys-Asn-Pro-Tyr）所对应的密码子共有150bp的核苷酸。另外，在核酸序列的前面添加一个起始密码子的序列（3bp）和一个限制性内切酶EcoRI的酶切位点（6bp）。在序列的末端加上6个组氨酸的序列（18bp），一个终止密码子（3bp），另外加上三个限制性内切酶（Xho I,Sal I,Pst I）的核酸序列（17bp）。这样设计好的杂合肽囊素核酸序列共包括197个核苷酸（N197序列）。

2 含有杂合肽囊素N197序列原核表达载体的构建与鉴定

把合成好的杂合肽囊素N197序列与线性化后的PET32a(Novagen公司商品化产品)原核表达载体进行连接，连接产物转化大肠杆菌宿主后，用酶切鉴定的方法筛选含N197的PET32a载体的宿主菌。

3杂合肽囊素在大肠杆菌中的诱导表达

以终浓度为1mM的IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)对含杂合肽囊素序列的宿主菌进行诱导表达，同时以含PET32a空载体质粒的BL-21菌同样诱导处理后样品为阴性对照。以SDS-PAGE电泳结果来分析杂合肽囊素在大肠杆菌中的表达水平。

4重组大肠杆菌杂合肽囊素N197的纯化

利用SDS-PAGE电泳来对杂合肽囊素N197的表达条带进行分离，并通过切胶回收的方法对重组杂合肽囊素N197进行分离、纯化，并可以进一步利用SDS-PAGE电泳对切胶回收的杂合肽囊素N197的纯度进行分析。

5纯化后的重组杂合肽囊素N197的体外免疫活性测定（碧云天生物公司的CCK8试剂盒）

取鸡外周血，并分离出淋巴细胞，在LPS的作用下，测定纯化后的重组杂合肽囊素N197在体外促进B淋巴细胞增殖的免疫活性，并设立相应的阴性对照和空白对照。

6重组杂合肽囊素N197体外免疫佐剂活性的测定