[发明专利]一种乳及乳制品中低分子肽的提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于分子筛提取、固相萃取净化乳及乳制品中小肽、寡肽和多肽（50个氨基酸以下）的方法，可应用于人乳、牛乳、羊乳及其乳制品中低分子肽的提取、净化、和检测领域，在含肽类产品肽的检测、活性肽功能性产品的研发等方面也具有良好的应用价值。

背景技术

源于蛋白质的低分子肽是一种多功能因子，组成结构包括几个氨基酸残基的短肽链的小肽以及寡肽（5～10个氨基酸）和多肽（11～50个氨基酸）；这类肽能直接被机体吸收利用，具有吸收效率高、免疫原性低等特点。此外，它们还在细胞生理及代谢功能的调节上具有重要的作用，这些调节作用几乎涉及到人体所有的生理活动，如神经系统、消化系统、循环系统、内分泌系统等。不仅如此，其中许多肽还具有原蛋白质或其组成氨基酸所没有的新功能。特别是以数个氨基酸结合生成的低肽不仅有比蛋白质更好化吸收性能，还具有促进免疫、调节激素、抗菌、抗病毒、降血压和降血脂等生理机能‘迄今短肽的发现已经成为多肽类药物和功能性食品添加剂的开发热点，而且也是当前食品科技界最热门的研究课题和极具发展前景的功能因子。

在乳及乳制品中肽的研究主要集中在两个方面，一是人乳中活性肽的研究，人乳经过自然进化与适应，成为婴幼儿最佳的食品，除了蛋白、脂肪和乳糖外，人乳中还含有丰富的肽，这些肽对消化、吸收、神经、免疫等各个系统均不完善的婴幼儿至关重要。随着婴幼儿配方食品带来如过敏、上火、结石、腹泻等诸多问题，以牛乳为原料的配方奶粉母乳化程度需进一步提高，对人乳中生物功能肽的深入研究更是显得迫切。二是乳源活性肽功能性食品的开发，研究者对乳及乳制品中的生物活性肽研究的日益深入，越来越多的乳源性生物活性肽被发现，鉴于生物活性肽在心血管系统，免疫系统，消化系统及神经系统等均有诸多作用，人们逐渐利用这些乳源性的生物活性多肽所具有的生物活性作用来制造健康食品或功能性食品，以期提升人类健康水平。

提取、净化技术是低分子肽的定性、定量、结构和功能研究的基础；传统的肽的提取方法是采用缓冲盐浸取、超声提取，或蛋白经过酶切后，将未消化的蛋白采用盐、有机溶剂或其他试剂沉淀，离心后直接取上清浓缩。这些提取方法所得到的是粗提物，提取效果差，杂质多；并且对仿母乳婴幼儿配方奶粉的研制和乳品中生物活性肽的研究不利。

发明内容

本发明的目的是克服上述背景技术的不足，提供一种乳及乳制品中天然低分子肽的提取方法，该方法应具有提取效果好、净化性能佳的优点。

本发明提供的技术方案是：

一种乳及乳制品中低分子肽的提取方法，按以下步骤进行：

1）初提

用缓冲液将生鲜乳稀释1～5倍，或用缓冲液将乳粉稀释5～15倍，用正己烷或乙醚—石油醚混合溶液去除脂类；接着采用超滤膜以及离心或抽滤的方式去除乳与乳制品中的高分子蛋白和其他颗粒物，得到低分子肽初提取液；乙醚—石油醚混合溶液中，乙醚的体积比例为30%～70%，其余是石油醚；

2）初净化

将上述初提取液经过C18反相固相萃取柱的萃取；接着先用1%—5%的甲醇溶液或乙腈溶液洗去前述萃取柱上的强极性的杂质，然后用40%—70%的甲醇洗脱溶液或乙腈洗脱溶液将前述萃取柱上的低分子肽洗脱下来，收集洗脱溶液；最后旋转蒸发掉洗脱溶液中的甲醇或乙腈，剩下的溶液即为低分子肽初净化液；

3）再净化

用盐酸或硫酸或甲酸或乙酸溶液将获得的初净化液pH值调到2～4以内，以使低分子肽上的氨基“—NH₂”带上H⁺变为“—NH₃⁺”；接着将前述溶液通过带有负电荷基团的阳离子交换固相萃取小柱，以将低分子肽吸附并富集在该固相树脂上；随后，依次用酸性、中性洗涤液将不带电荷的有机小分子物质和杂质洗涤掉，再用氨水甲醇溶液洗脱固相树脂，使低分子肽上的“—NH₃⁺”重新成为不带电荷的“—NH₂”状态，并随氨水甲醇溶液洗脱下来，收集洗脱液；

4）蒸发

洗脱液经过低温氮吹至净干，得到高纯度的低分子肽混合物。

所述步骤1）中的缓冲液是磷酸盐缓冲液（PBS），或者是柠檬酸缓冲液，或者是NaCl溶液。

所述超滤膜是截留分子量为5K的超滤膜。

所述步骤2）中的甲醇洗脱溶液的成分为甲醇和水，其中甲醇的体积含量为40%～70%。

所述步骤2）中的乙腈洗脱溶液的成分为乙腈和水，其中乙腈的体积含量为40%～70%。