[发明专利]一种COL4A5基因突变的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因突变检测技术领域，特别是涉及一种COL4A5基因突变的检测方法。

背景技术

Alport综合征（Alport syndrome,AS），又称为遗传性肾炎、家族性肾炎、遗传性进行性肾炎，是一种主要表现为血尿、肾功能进行性减退、神经性耳聋和眼部异常的遗传性肾小球基底膜（glomerular basement membrane,GBM）疾病。

临床上AS并非罕见，据文献报道AS在肾小球疾病中占2%，在终末期肾衰病人中约占5%，在肾移植病例中约占2.3%，在成人肾活检中占0.3%，而在儿童肾活检中占1.7-2.5%。同时AS具有临床异质性，临床表现多样，典型患者具有家族史，表现为血尿、蛋白尿、进行性肾功能不全伴眼耳病变，但相当一部分患者临床表现极不典型，可仅表现为镜下血尿和/或蛋白尿。我国AS患者在临床上具有蛋白尿表现较重，耳聋、眼部异常的发生率较高，尤其是青少年型较多等特点。因此，寻求筛查和诊断AS的有效手段一直是国内外科研工作者和临床医生努力的方向。

随着对AS认识的逐渐深入以及电镜检查、Ⅳ型胶原α5链的1FI和基因突变检测技术的进步，AS已由“眼、耳、肾疾患”这一临床综合症的诊断发展为包括临床、病理、遗传型以及突变基因的综合诊断，临床上对AS的确认率有了明显的提高。但相比较而言，临床上AS的总检出率仍较低，因此建立一种普遍适用的筛查手段极待解决。

按照AS的遗传方式，可分为伴X染色体显性遗传、常染色体显性遗传和常染色体隐性遗传3种，其中X连锁显性遗传占总AS人数的85%。伴X染色体显性遗传的AS病变基因位于X染色体长臂中部Xq21-q22，其基因突变为编码Ⅳ型胶原α5链的COL4A5。COL4A5基因共有51个外显子，大小为140kb。自1990年Barker等报道第一个COL4A5基因突变，至今已有400多种COL4A5基因突变被发现，其中大多为小片段突变，包括错义突变、无义突变、剪接突变、单个碱基缺失或插入等。因此，对COL4A5基因的分析研究对Alport综合征患者的诊断及其家系成员的遗传咨询意义重大。

目前，国际上普遍采用的COL4A5基因检测是从基因组DNA水平进行PCR扩增测序来检测突变，然而这种方法费时费力。2002年王芳等人创新开展了从患者皮肤成纤维细胞经体外培养提取mRNA，通过RT-PCR分5个片段扩增COL4A5基因，其与基因组DNA分析COL4A5基因相比不仅经济而且显著提高了COL4A5基因突变检出率（王芳,丁洁,俞礼霞,杨霁云，检测皮肤成纤维细胞cDNA确定Alport综合征COL4A5基因突变，北京大学学报(医学版)；2002，34(3)：219-224.）。然而，皮肤成纤维细胞体外培养对环境和操作者要求严格，细胞培养耗时长达2～4个月，且培养费用高昂，从而增加了COL4A5基因检测的成本，因此研究探索新的方法检测COL4A5基因突变非常必要。

发明内容

本发明的首要目的是针对上述现有技术存在的问题提供一种耗时短、成本低、无需进行体外培养的COL4A5基因突变的检测方法，本方法操作方便、简单易行，还有利于异地样本的转运。

为了达到上述目的，本发明一方面提供一种COL4A5基因突变的检测方法，包括如下步骤：

A）从脱离人体的皮肤组织中直接提取RNA；

B）对RNA进行RT-PCR，得到PCR扩增产物；

C）对PCR扩增产物进行测序，将测序结果与正常人体COL4A5基因序列进行比对，分析是否发生基因突变。

其中，所述皮肤组织的表面积≥4mm²，优选为4-8mm²，进一步优选为4mm²。

特别是，从所述脱离人体的皮肤组织中直接提取得到的RNA的量≥2μg。

其中，所述步骤A）包括：

A1）将脱离人体的皮肤组织与液氮混合后进行研磨处理，得到研磨混合物；

A2）向研磨混合物中加入Trizol试剂提取RNA，得到RNA提取液；

A3）纯化RNA提取液，得到RNA。

特别是，步骤A1）中所述皮肤组织与液氮混合后进行研磨处理的目的是使皮肤组织脆化，从而更有利于皮肤组织的破碎；所述研磨处理可以采用研钵或本发明的皮肤组织研磨装置进行。

尤其是，步骤A3）中所述纯化处理包括：首先采用氯仿去除RNA提取液中的蛋白类杂质；再采用异丙醇沉淀RNA；最后采用75%的乙醇洗涤RNA沉淀。